Исследование эффектов грибов Cantharellus cibarius (Лисички обыкновенные) на трематоду O. felineus и на хозяина паразита – инбредных мышей C57BL/6

М.А. Цыганов^{1, 2}, Г.Б. Вишнивецкая¹, Т.П. Кукина³, И.В. Сорокина³, М.Н. Львова^{1, 4}, М.А. Проценко⁵, Н.Е. Костина¹, Д.Ф. Августинович¹

1. Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск, Россия
2. Новосибирский национальный исследовательский государственный университет, Новосибирск, Россия
3. Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск, Россия
4. Новосибирский государственный медицинский университет Минздрава России, Новосибирск, Россия
5. Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, Новосибирская область, р. п. Кольцово, Россия

HOW TO CITE THIS ARTICLE:
Tsyganov M.A., Vishnivetskaya G.B., Kukina T.P., Sorokina I.V., Lvova M.N., Protsenko M.A., Kostina N.E., Avgustinovich D.F. Effects of the mushroom Can­tharellus cibarius on the liver fluke O. felineus and hosting inbreed C57BL/6 mice. Vavilovskii Zhurnal Genetiki i Selektsii=Vavilov Journal of Genetics and Breeding. 2018;22(7):856-864. DOI 10.18699/VJ18.426

Описторхоз - опасное паразитарное заболевание, вызывае­мое трематодами семейства Opistorchiidae, в том числе видом Opisthorchis felineus, распространенным на территории Россий­ской Федерации и Западной Европы. В наше время остается актуальным поиск новых препаратов для лечения описторхоза с максимальным противопаразитарным и минимальным побочным действием. В работе исследованы потенциальные антигельминтные эффекты экстракта грибов Лисичка обыкно­венная (Cantharellus cibarius). В экспериментах in vitro пока­зано, что при повышении концентрации экстракта C. cibarius (10-1000 мкг/мл) подвижность и выживаемость ювенильных особей O. felineus значительно снижается. В исследованиях in vivo экстракт C. cibarius, вводимый мышам инбредной линии C57BL/6 в первые сутки после инфицирования, приводил к снижению количества гельминтов в желчных протоках печени, оцениваемому через шесть недель после инфицирования.

В другой серии экспериментов введение экстракта в течение семи дней мышам с пятинедельным сроком инфицирования не оказывало антигельминтного эффекта. В обоих случаях со­стояние хозяина паразита, оцениваемое по ряду физиологиче­ских и биохимических параметров, не ухудшалось, что говорит об отсутствии какого-либо негативного действия экстракта C. cibarius. Полученные результаты свидетельствуют в пользу возможных антигельминтных свойств экстракта C. cibarius при применении на стадии эксцистирования личинок паразита.

Ключевые слова: Opisthorchis felineus; метанольный экстракт Cantharellus cibarius; мыши C57BL/6; биохимические показатели крови.

Effects of the mushroom Cantharellus cibarius on the liver fluke O. felineus and hosting inbreed C57BL/6 mice

M.  A. Tsyganov^{1, 2}, G.B. Vishnivetskaya¹, T.P. Kukina³, I.V. Sorokina³, M.N. Lvova^{1, 4}, M.A. Protsenko⁵, N. E. Kostina¹, D.F. Avgustinovich¹

1. Institute of Cytology and Genetics, SB RAS, Novosibirsk, Russia
2. Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russia
3. N.N. Vorozhtsov Novosibirsk Institute of Organic Chemistry, SB RAS, Novosibirsk, Russia
4. Novosibirsk State Medical University, Novosibirsk, Russia
5. State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector" Koltsovo, Novosibirsk region, Russia

Opisthorchiasis is a dangerous parasitic disease caused by trematodes in the family Opisthorchiidae. One of the causes of this infection is the species Opisthorchis felineus, which is common in the Russian Federation and Western Europe. The disease has a large number of complications and relatively few effective treatments, so nowadays it is relevant to look for new drugs for the treatment of opis­thorchiasis, with the maximum antiparasitic and minimal side effect. In this work, a potentially anthelmintic effect of the methanol extract of the golden chanterelle mushroom (Cantharellus cibarius) was investigated. In in vitro experi­ments, the significantly reduced mobility and survival rates of juvenile O. felineus specimens with increasing concen­trations (10-1000 pg/ml) of the C. cibarius extract were shown. In in vivo studies, administration of the C. cibarius extract on the first day after parasitic infection of inbred C57BL/6 mice resulted in a decrease of the number of helminths in the bile ducts of the liver, evaluated 6 weeks after infection. In another series of experiments, adminis­tration of the C. cibarius extract for 7 days to mice infected with O. felineus for five weeks had no anthelmintic effect.

In both cases, the state of the infected hosts, evaluated by a number of physiological and biochemical parameters (relative weight of organs, blood indices), did not dete­riorate, indicating that there was no adverse effect of the C. cibarius extract. The results obtained suggest that the C. cibarius extract might have anthelmintic properties if applied as parasite larvae excyst.

Key words: Opisthorchis felineus; methanolic extract of Cantharellus cibarius; C57BL/6 mice; blood biochemical markers.

Описторхоз - заболевание гепатобилиарной системы и поджелудочной железы, вызываемое трематодами семейства Opisthorchiidae, в том числе Opisthorchis felineus. В Российской Федерации самый крупный очаг O. felineus-индуцированного описторхоза - Обь-Иртышский регион, где инфицирование гельминтами городского населения достигает 80 %, а сельского - 90 % и более (Mordvinov et al., 2012; Yurlova et al., 2017). Описторхоз характеризуется воспалительными процессами в печени и желчевыводящих каналах (Sripa, 2003; Nair et al., 2011). Инфекция O. felineus обусловливает много­численные патологии печени и поджелудочной железы: холангит, холецистит, стриктуры желчевыводящих про­токов, желчекаменную болезнь, гепатитоподобные сим­птомы (желтуха, гепатомегалия), панкреатиты (Пальцев, 2005; Saltykova et al., 2016). Некоторые авторы отмечают корреляцию инфицирования O. felineus с онкологией гепатобилиарной системы и поджелудочной железы у чело­века (Бражникова, Толкаева, 2002).

В связи с масштабностью распространения описторхоза, длительностью течения и серьезными последстви­ями, которые он вызывает в организме инфицированных людей и животных, ведется постоянный поиск способов лечения и их апробация на лабораторных животных. Для этого описторхоз чаще всего моделируют на золоти­стых хомячках Mesocricetus auratus (Pinlaor et al., 2009; Pakharukova et al., 2015), которые, однако, не являются естественными хозяевами для этого вида трематод. Ис­следования описторхоза проводятся также на нокаутных (Nair et al., 2011) и инбредных C57BL/6 мышах (Зеленцов, 1974; Avgustinovich et al., 2016-2018; Августинович и др., 2017). Для O. felineus-инфицированных мышей C57BL/6 характерна пролонгированная (до 6 недель) стадия юве­нильной мариты, что отличает их от хомячков. Это дает некоторые преимущества при исследовании хронических эффектов препаратов на неполовозрелых описторхов.

Главным и наиболее эффективным препаратом для лечения описторхоза у человека является празиквантел. Ряд авторов предполагают развитие устойчивости пара­зита к действию препарата (Greenberg, 2014). Также у празиквантела отмечают побочные эффекты (Erko et al., 2012) и значительное цитотоксическое влияние на клетки печени (Sripa et al., 2011). Поэтому в настоящее время остается актуальным поиск других соединений, эффек­тивных при описторхозе. В качестве потенциального источника подобных веществ рассматривают грибы рода Лисичка (Cantharellus), в частности распространенный на территории РФ гриб Лисичка обыкновенная (C. cibarius). В природе эти грибы проявляют антинематодные свойства (Muszynska et al., 2016). Отмечено их широкое примене­ние в народной медицине (Cieniecka-Roslonkiewicz et al., 2007), поскольку гриб содержит вещества с потенциально лекарственными свойствами при различных заболевани­ях (Valverde et al., 2015; Nyman et al., 2016). Методами in vitro и in vivo установлены высокие антиоксидантные и противовоспалительные свойства экстрактов грибов, причем у алкогольных экстрактов более выраженные, чем у водных (Vamanu, Nita, 2014). Метанольный экстракт грибов имеет преимущества по сравнению с водным, по­скольку оказывает противомикробное действие (Kozarski et al., 2015; Muszynska et al., 2016), а его антимикробная активность в отношении Escherichia coli в семь раз выше, чем у этанольного (Aina et al., 2012). У мышей используют однократное или хроническое внутрибрюшинное введе­ние метанольных экстрактов C. cibarius в диапазоне доз 200-800 мг/кг (Khalili et al., 2014, 2015).

Эффективность C. cibarius при лечении описторхозных инфекций не изучалась. Поэтому целью данного исследо­вания было определение антигельминтных свойств метанольного экстракта C. cibarius при двух режимах введения мышам инбредной линии C57BL/6: на стадии внедрения O. felineus (первые сутки инфицирования) и на стадии уже прикрепившихся к желчным протокам печени паразитов (5 недель инфицирования). Действие экстракта грибов на O. felineus оценивали также в условиях in vitro. Кроме того, предполагалось получить и сопоставить химический состав метанольного и этанольного экстрактов C. cibarius.

Материалы и методы

Животные. Половозрелые самцы мышей линии C57BL/6 были получены из Центра генетических ресурсов лабора­торных животных (RFMEFI61914X005 и RFMEFI61914 X0010) ФИЦ Институт цитологии и генетики (ИЦиГ) СО РАН. Животных содержали группами по 3-6 особей в стандартных клетках 36 * 23 * 10 см при световом режиме 12:12 ч (день: ночь), температуре воздуха 24 °С, наличии корма и воды ad libitum. Все процедуры были проведены согласно директивам European Communities Council от 24.11.1986 (86/609/EEC), а также в соответствии с тре­бованиями Комиссии по биоэтике ФИЦ ИЦиГ СО РАН (протокол № 26 от 13.03.2015).

Метацеркарии O. felineus были выделены из естест­венно зараженных язей (Leuciscus idus), обитающих в реке Обь в черте г. Новосибирска. Метацеркарии были промыты 0.9 % стерильным раствором NaCl и далее со­держались в нем при температуре 4 °С не более суток для экспериментов in vivo и до 7 дней в стерильном растворе натрий-фосфатного буфера с добавкой антибиотика канамицина (25 мкг/мл) для экспериментов in vitro.

Экстракты C. cibarius были получены из грибов C. cibarius, собранных в Новосибирской области, и при­готовлены по методике Т.П. Кукиной с соавторами (2016). Для этого высушенные при температуре не выше 40 °С грибы измельчали на электрической мельнице, далее из­мельченное сырье просеивали через сито с отверстиями размером 2 мм. Навеску в количестве 50 г загружали в насадку Сокслета и экстрагировали в течение 20 ч. В качестве экстрагентов использовали метанол, этанол и этанол с доэкстракцией метанолом. Полученные экс­тракты упаривали досуха на роторном испарителе Buchi (Швейцария) с термостатированной водяной баней при температуре 40 °С и пониженном (20-30 мм рт. ст.) дав­лении, обусловленном применением водоструйного на­соса. В экспериментах in vivo и in vitro был использован метанольный экстракт согласно рекомендациям (Aina et al., 2012). Для исследований in vivo экстракт C. cibarius суспендировали в 10 % Tween 80, который применяется в экспериментах на животных в качестве растворителя (Teufack et al., 2017). В исследованиях in vitro экстракт растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO).

Анализ подвижности ювенильных червей проводили через 24, 72, 120 и 168 ч после добавления препарата на основе методики (Keiser et al., 2013). Подвижность оце­нивали визуально с помощью микроскопа Axiovert 40CFL (Zeiss, Германия) по 4-балльной шкале (4 - активное не­прерывное движение червя, 3 - слабо выраженные мед­ленные движения всего тела, 2 - очень редкие движения, чаще всего ограниченные только одной областью тела, 1 - полная неподвижность), затем нормировали по конт­рольной группе (1 % DMSO). Через сутки после добав­ления препаратов вычисляли среднеэффективную кон­центрацию препарата, при которой происходит полное прекращение подвижности у 50 % всех червей (IC₅₀) с помощью программы CompuSyn 1.0 (ComboSynInc).

Исследования in vivo. Были использованы две схемы введения экстракта C. cibarius инфицированным живот­ным. В первой серии экспериментов в 18:00 половине жи­вотных были введены метацеркарии (100 личинок/мышь), находящиеся в 0.1 мл физиологического раствора, второй половине - 0.9 % NaCl. На следующий день в 10:00 одно­кратно вводили раствор экстракта C. cibarius или раство­ритель (10 % Tween 80). При этом половине животных в каждой группе вводили экстракт C. cibarius, другой поло­вине - растворитель. В каждой подгруппе было 7-14 мы­шей. Во второй серии экспериментов экстракт C. cibarius (или растворитель) вводили инфицированным животным ежедневно в течение 7 дней через 5 недель после введения метацеркарий O. felineus. Использовали две группы по 14-15 мышей. Вещества вводили внутрижелудочно с по­мощью специализированных зондов (Braintree Scientific, Inc., США). Доза препарата 600 мг/кг была выбрана, ис­ходя из литературных данных (Khalili et al., 2014).

В ходе обоих экспериментов регистрировали массу тела животных каждые 10 дней. Через 6 недель после инфи­цирования мышей умерщвляли быстрой декапитацией и производили забор биоматериала для дальнейшего иссле­дования. Печень, селезёнку и тимус взвешивали и опреде­ляли относительную массу органов в пересчете на грамм массы тела. Печень помещали в раствор 0.9 % NaCl для последующего подсчета количества паразитов в желчных протоках и желчном пузыре и определения состояния их зрелости. При обнаружении червей и анализе состояния желчных протоков печени использовали световой микро­скоп Axiovert 40CFL (Zeiss, Германия) с увеличением x4. Кровь, собранную при декапитации, центрифугировали при 3 000 об/мин, 4 °С в течение 20 мин, сыворотку от­деляли и хранили при -70 °С до начала биохимических исследований.

Биохимическое исследование. Активность ферментов аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), лактатде­гидрогеназы (ЛДГ), содержание глюкозы (ГЛЮ), общего белка (ОБ), холестерина (ХОЛ), триглицеридов (ТГ) в сыворотке крови определяли с помощью стандартных наборов реактивов (Biocon, Индия). Измерения были вы­полнены на биохимическом полуавтоматическом анали­заторе Фотометр-5010 (Boehringer Mannheim, Германия).

Исследование химического состава экстрактов C. ci­barius. Содержание белка, полисахаридов, фенольных соединений, флавоноидов и каротиноидов в экстрактах C. cibarius определяли по ранее описанному методу (Про­ценко и др., 2018).

Статистическая обработка результатов осуществля­лась с помощью пакета программ Statistica 6.0 (StatSoft). Для первой схемы введения применяли двухфакторный дисперсионный анализ: в качестве первого фактора ис­пользовали «инфицирование» (инфицированные, неинфи­цированные), в качестве второго - «препарат» (экстракт C. cibarius, растворитель). Для анализа эффекта экстракта по второй схеме введения использовали однофактор­ный дисперсионный анализ. Изменения массы тела оце­нивали критерием Уилкоксона для парных сравнений. Данные представлены как среднее значение ± ошибка среднего. Результаты считались статистически значимыми при p < 0.05 и на уровне тенденции при 0.05 < p < 0.1. Вы­живаемость паразитов в эксперименте in vitro оценивали по методу Каплана-Мейера, сравнение кривых выжи­ваемости производили по методу х². Кривые считались различающимися приp < 0.05.

Результаты

Исследования in vitro

В первые минуты после внесения экстракта или 1 % DMSO не было обнаружено изменений внешнего вида или активности червей. Через 24 часа подвижность червей в лунках с концентрациями экстракта 10, 100 и 1000 мкг/мл была на 6.15, 7.69 и 41.15 % соответственно меньше под­вижности в контрольной группе. В дальнейшем (через 72-120 ч) подвижность червей постепенно уменьшалась. Через 120 ч в группе 10 мкг/мл подвижность была на 64 % меньше контрольной, в группе 100 мкг/мл - на 71.2 % меньше, в группе 1000 мкг/мл наблюдалось полное пре­кращение подвижности. Через 168 ч наступала гибель большей части червей. Подсчитанная через 24 ч после добавления препарата IC₅₀ экстракта C. cibarius была равна 1.58 мг/мл.

На каждом этапе наблюдения производили подсчет погибших (неподвижные, непрозрачные) червей. Смерт­ность в контрольной группе составляла 0 % через 24 ч после начала эксперимента, 9.41 % - через 72 ч, 37.65 % - через 120 ч и 87.65 % - через 168 ч. В группе с концен­трацией экстракта C. cibarius 10 мкг/мл эти показатели составили 2.08, 29.86, 70.14 и 97.92 % соответственно. При концентрации экстракта 100 мкг/мл получены значения 3.96, 37.62, 77.23 и 91.19 % соответственно, а при кон­центрации экстракта 1000 мкг/мл - 12.08, 87.25 и 100 % через 120-168 ч. Во всех случаях графики выживаемости паразитов при введении C. cibarius статистически зна­чимо отличались от контрольных значений (10 мкг/мл: X² = 41.57, p = 1.14- 10^-10; 100 мкг/мл: х² = 17.33, р = = 3.13 • 10^-5; 1000 мкг/мл: х² = 227.48, р = 0.000).

Рис. 1. Внешний вид ювенильных особей O. felineus через 72 ч после действия 10 мкг/мл (а), 100 мкг/мл (б) и 1000 мкг/мл (в) экстракта C. cibarius и растворителя (г).
Стрелки указывают на экскреторные пузыри.

Таблица 1. Относительная масса органов (мг/г) после однократного введения экстракта C. cibarius в первые сутки после инфицирования мышей O. felineus

Примечание. Of - фактор «инфицирование»; Cc - фактор «препарат». #p < 0.05 по сравнению с аналогичной контрольной группой.

Исследования in vivo

Однократное введение экстракта C. cibarius в первые сутки после инфицирования привело к статистически значимому (F_1;20 = 4.36; p = 0.048) снижению количества паразитов в желчных протоках печени животных через 6 недель после инфицирования (18.1 ± 1.5) по сравнению с этим показателем в контрольной группе (23.5 ± 2.2). При исследовании под микроскопом не обнаружено существенных изменений внешнего вида паразитов, вы­деленных из печени мышей с введением и без введения экстракта C. cibarius. Черви были преимущественно не­половозрелые, с хорошо визуализируемыми двумя вет­вями кишечника. В обеих группах у одного из животных обнаружено по одной половозрелой особи O. felineus.

У мышей исследуемых групп не установлено значимого влияния факторов «инфицирование» и «препарат» на от­носительную массу печени и селезёнки; взаимодействия факторов не было (табл. 1). Отмечено увеличение массы тимуса у O. felineus-инфицированных животных, получав­ших экстракт C. cibarius, по сравнению с аналогичными мышами контрольной группы.

Не обнаружено влияния экстракта C. cibarius на при­рост массы тела животных за 6 недель эксперимента: в каждой подгруппе мыши в равной степени набирали вес, который увеличился в среднем на 2.5-3 г.

Во второй серии экспериментов введение экстракта C. cibarius в течение 7 дней через 5 недель после инфи­цирования не вызывало статистически значимого из­менения количества паразитов (26.2 ± 0.89 - C. cibarius, 28.4 ± 1.85 - растворитель; F_1;29 = 1.16, р = 0.292). При этом черви, выделенные из желчных протоков после введения растворителя и экстракта C. cibarius, различались: у по­следних был существенно увеличен экскреторный пузырь (рис. 2, а, б). У всех мышей обнаруженные черви были неполовозрелыми, с хорошо визуализируемыми двумя ветвями кишечника. И только у двух в каждой группе мышей было обнаружено по одной половозрелой особи O. felineus (см. рис. 2, в).

Рис. 2. Внешний вид особей O. felineus, выделенных из печени мышей: а - контрольная группа; б - группа, получавшая экстракт C. cibarius; в - половозрелая особь O. felineus.

Таблица 2. Биохимические показатели крови контрольных и O. felineus-инфицированных мышей после однократного введения веществ

* p < 0.05 - по сравнению с растворителем;
# p < 0.05;
## p < 0.01;    0.05 < p < 0.1 - по сравнению с аналогичной контрольной группой.

Биохимический анализ крови

Результаты биохимических исследований у инфициро­ванных и неинфицированных мышей, которым одно­кратно вводили C. cibarius либо растворитель, приведены в табл. 2. Двухфакторным дисперсионным анализом не установлено влияния фактора «препарат» на активность АЛТ (F^Cc_1;35 = 0.01, p = 0.915), АСТ (F^Cc_1;35 = 0.02, p = 0.898) и ЛДГ [F^Cc_1;35 = 0.29, p = 0.591). Влияние фактора «инфи­цирование» было значимым и при введении экстракта C. cibarius, и при введении растворителя (АЛТ: F^Of_1;35 = = 13.16, p = 0.001; АСТ: F^Of_1;35 = 14.06, p = 0.001; ЛДГ: F^Of_1;35 = 12.68, p = 0.001). Взаимодействия факторов не выявлено (АЛТ: F^CcxOf_1;35 = 0.06, p = 0.805; АСТ: F^CcxOf_1;35 = = 0.25, p = 0.623; ЛДГ: F^CcxOf_1;35 = 0.05, p = 0.821). Для ЩФ установлено достоверное влияние как фактора «инфици­рование» (F^Of_1;35 = 7.35, p = 0.010), так и фактора «препарат» (F^Cc_1;35 = 451, p = 0.041) при отсутствии взаимодействия факторов (F^CcxOf_1;35 = 1.06, p = 0.311). Как показало после­дующее post hoc сравнение, в группе неинфицированных животных активность ЩФ снижалась при введении экс­тракта C. cibarius, чего не наблюдалось у инфицированных мышей. Более того, на фоне введения экстракта C. cibarius у инфицированных мышей обнаружена значительно более высокая автивность ЩФ, чем у неинфицированных. Влияния факторов «препарат» и «инфицирование» на уровень глюкозы были статистически значимыми (FCc 1;35 = 4.54, p = 0.040; FOf 1;35 = = 4.23, p = 0.047 соответственно), взаимодействия факторов не было (FCcxOf 1;35 = 0.01, p = 0.937). Однако post hoc сравнение не выявило каких-либо различий между группами. Не обнаружено влияния фактора «препарат» и на содержание общего белка (FCc 1;35 = 1.45, p = 0.237), триглицеридов (FCc 1;35 = 0.10, p = 0.757) и холестерина (FCc 1;35 = 0.34, p = 0.565). Фактор «инфицирование» (FOf 1;35 = 4.22, p = 0.047) обусловливал заметное, но статистически незначимое снижение уровня ТГ на фоне введения растворителя (p = 0.072). Влияния инфицирования на содержание белка и холестерина в крови не обнаружено (FOf 1;35 = 0.61, p = 0.441; FOf 1;35 = 1.65, p = 0.207). По всем трем показателям взаимодействие факторов отсутствовало (ОБ: FCcxOf 1;35 = 0.01, p = 0.914; ТГ: FCcxOf 1;35 = 0.85, p = 0.362; ХОЛ: FCcxOf 1;35 = 0.87, p = 0.357). В табл. 3 приведены результаты биохимических исследований у инфицированных мышей, которым вводили растворитель либо экстракт C. cibarius ежедневно в течение 7 дней через 5 недель инфицирования. По всем оцениваемым показателям, кроме содержания глюкозы в крови, мыши сравниваемых групп не различались (АЛТ: F1;27 = 0.01, p = 0.936; АСТ: F1;27 = 1.14, p = 0.295; ЩФ: F1;27 = 0.04, p = 0.838; ЛДГ: F1;27 = 2.64, p = 0.116; ОБ: F1;27 = 1.28, p = 0.268; ХОЛ: F1;27 = 0.004, p = 0.951; ТГ: F1;27 = 0.004, p = 0.949). Экстракт C. cibarius статистически значимо повышал уровень глюкозы (F1;37 = 5.35, p = 0.029).

Таблица 3. Биохимические показатели крови у O. felineus-инфицированных мышей после 7-дневного введения веществ

* p < 0.05 по сравнению с растворителем.

Таблица 4. Композиционный состав экстрактов C. cibarius при трех способах экстрагирования

В табл. 3 приведены результаты биохимических ис­следований у инфицированных мышей, которым вводи­ли растворитель либо экстракт C. cibarius ежедневно в течение 7 дней через 5 недель инфицирования. По всем оцениваемым показателям, кроме содержания глюкозы в крови, мыши сравниваемых групп не различались (АЛТ: F₁₂₇ = 0.01, p = 0.936; АСТ: F₁₂₇ = 1.14, p = 0.295; ЩФ: Fj^;₂₇ = 0.04, p = 0.838; ЛДГ: Fj.₂₇ = 2.64, p = 0.116; ОБ: f;₂₇ = 1.28, p = 0.268; ХОЛ: F₁₂₇ = 0.004, p = 0.951; ТГ: F₁₂₇ = 0.004,p = 0.949). Экстракт C. cibarius статистически значимо повышал уровень глюкозы (F_{1 37} = 5.35, p = 0.029).

Состав экстрактов C. cibarius

В результате анализа состава различных экстрактов C. cibarius было обнаружено, что при метанольной экстракции лучше выделяются фенольные соединения, а при этанольной - каротиноиды (табл. 4). Повторная экстракция в этаноле после метанольной экстракции способствует увеличению количества полисахаридов и фенольных соединений, но сопровождается значительной потерей белка. Во всех трех случаях экстрагирования выделено одинаковое и незначительное количество флавоноидов.

Обсуждение

В настоящей работе нами получены первые данные по антигельминтной активности экстракта C. cibarius на модели O. felineus-индуцированного описторхоза у мы­шей. Для экстрактов C. cibarius ранее были показаны противовоспалительные эффекты (Vamanu, Nita, 2014), инсектицидная активность (Cieniecka-Roslonkiewicz et al., 2007), антиоксидантные и гепатопротекторные свойства - уменьшение фибротических изменений в печени при ин­дуцированном воспалении (Aina et al., 2012; Khalili et al., 2014, 2015), а также цитотоксические эффекты на раковые клетки в условиях in vitro (Sari et al., 2017). Учитывая это, можно было ожидать возможного угнетающего действия C. cibarius непосредственно на гельминта.

В экспериментах in vitro показано, что выживаемость и подвижность ювенильных особей O. felineus существенно снижаются с увеличением дозы экстракта C. cibarius в инкубационной среде. Через 120 ч после начала экспе­римента активно двигающиеся описторхи были только в контрольной группе. Увеличение экскреторного пузыря у паразитов тоже свидетельствует в пользу антигель­минтной активности C. cibarius: сходные морфологиче­ские изменения наблюдали при действии празиквантела (Pakharukova et al., 2015). Полагают, что празиквантел нарушает метаболизм паразита, действуя на белки мем­бранного транспорта, в том числе белки экскреторной системы паразита (Greenberg, 2014). Возможно, экстракт C. cibarius также оказывает эффект на работу экскретор­ной системы O. felineus.

Показатель IC₅₀ экстракта C. cibarius (1.58 мг/мл) намного превышает значения IC₅₀ других клинически применяемых препаратов, таких как празиквантел (IC₅₀ = 0.33 мкг/мл при действии на ювенильных и 0.14 мкг/мл - на взрослых особей) (Pakharukova et al., 2015) или используемый при клонорхозе трибендимидин (IC₅₀ = 0.05 мкг/мл при действии на взрослых особей) (Keiser et al., 2013). Возможно, это объясняется тем, что в состав использованного экстракта C. cibarius входят соединения, которые могут обладать самостоятельными потенциальными антигельминтными свойствами, но их количество в экстракте незначительно. Такими вещества­ми C. cibarius могут быть специфические бета-глюканы - иммуномодуляторы с цитотоксическим действием на опухолевые клетки (El Enshasy, Hatti-Kaul, 2013; Valverde et al., 2015; Sari et al., 2017), эргостерол - стероид грибов с известными антиоксидантными свойствами, а также фенольные соединения, например мирицетин и катехин, участвующие в антиоксидантных процессах (Ebrahimzadeh et al., 2015; Valverde et al., 2015; Muszynska et al., 2016). Некоторые авторы подчеркивают высокую активность флавоноидов (Kozarski et al., 2015). Установ­ленный нами состав экстракта C. cibarius свидетельствует о присутствии значительного количества полисахаридов, среди которых преобладают бета-глюканы (Muszynska et al., 2016), и в меньших количествах - флавоноидов и фенольных соединений. Эргостерол был ранее обнаружен в составе экстрактов C. cibarius другими исследователями (Muszynska et al., 2016).

В модели in vivo было установлено пролонгирование ювенильной стадии развития паразита у мышей по срав­нению с хомячками, обнаруженное нами и ранее (Avgu­stinovich et al., 2017, 2018). Почти все паразиты были неполовозрелыми - просматривались только две ветви ки­шечника, отсутствовали половые органы. У естественных хозяев (человек, кошка) паразиты через месяц инфициро­вания становятся половозрелыми (Беер, 2005). Это может указывать на существование у мышей особых механизмов резистентности к инфицированию O. felineus. В группах мышей с введением растворителя и экстракта C. cibarius при обеих схемах введения найдено лишь по одной по­ловозрелой особи. Поэтому можно предположить, что на фоне естественного развития червя экстракт не влияет на созревание особей O. felineus. Обнаруженное расширение экскреторного пузыря червей после введения мышам экстракта C. cibarius, аналогичное наблюдавшемуся в исследованиях in vitro, еще раз свидетельствует об анти­гельминтном влиянии экстракта C. cibarius на паразита.

Следует подчеркнуть, что однократное введение экс­тракта C. cibarius в первые сутки после инфицирования вызывало статистически значимое снижение количества червей в желчных протоках животных. Таким образом, впервые показан возможный превентивный антигельминт­ный эффект экстракта C. cibarius на модели O. felineus-индуцированного описторхоза. При 7-дневном введении экстракта C. cibarius спустя 5 недель после инфициро­вания статистически значимого изменения количества паразитов в желчных протоках печени мышей не было. Вероятно, через некоторое время после миграции O. felineus в желчные протоки они становятся невосприим­чивыми к эффектам экстракта C. cibarius даже в услови­ях более длительного введения. Следовательно, экстракт C. cibarius препятствует закреплению червей на стенках желчных протоков и способствует их вымыванию, но не эффективен против закрепившегося паразита. Однако мы не исключаем, что один из компонентов экстракта при большей его концентрации может оказать антигельминт­ный эффект и на более поздних стадиях инфицирования.

Под действием экстракта C. cibarius не наблюдалось из­менений относительной массы печени, селезёнки и тимуса как у интактных, так и у инфицированных животных при обеих схемах введения экстракта. Это говорит о том, что экстракт не оказывает видимого токсического действия на организм животных. Так как у инфицированных жи­вотных, получавших экстракт C. cibarius, был увеличен относительный вес тимуса по сравнению с получавшими экстракт неинфицированными животными, то можно предположить, что при паразитарных инфекциях экс­тракт C. cibarius способен стимулировать Т-клеточный иммунитет.

Экстракт C. cibarius не препятствовал нормальному приросту массы тела у животных в условиях однократ­ного введения, что предполагает отсутствие каких-либо негативных эффектов на организм хозяина паразита. На­блюдавшееся снижение массы тела мышей при недельном введении экстракта C. cibarius связано, скорее всего, с влиянием ежедневного стресса от процедуры введения веществ, что отмечают и другие авторы (Charmandari et al., 2005).

Инфицирование O. felineus вызывало повышение ак­тивности АЛТ, АСТ, ЛДГ. Такие изменения отмечают как при описторхозе, так и при других воспалительных процессах в печени (Wonkchalee et al., 2012). При этом введение экстракта C. cibarius не нормализовало, но и не ухудшало эти параметры. Можно предположить, что экс­тракт не оказывает негативного действия при однократном введении сразу после инфицирования животных, а также у мышей контрольной группы. В качестве положительного эффекта можно рассматривать снижение активности ЩФ, что указывает на возможное антихолестазное действие экстракта, поскольку повышение активности ЩФ на­блюдают при хроническом описторхозе и других забо­леваниях, вызывающих застой желчи (Dechakhamphu et al., 2010). Не исключено, что снижение активности ЩФ у неинфицированных животных под действием экстракта обусловлено N-глюканами, которые рассматриваются в качестве потенциальных иммуномодуляторов (Sari et al., 2017).

Семидневное введение экстракта C. cibarius, судя по биохимическим показателям крови, также не оказывало заметного лечебного эффекта на инфицированных жи­вотных, но при этом не отмечено и негативного влияния экстракта. Наблюдаемый повышенный уровень глюкозы в крови животных может быть обусловлен стрессом от процедуры введения препаратов.

Таким образом, проведенное исследование выявило антигельминтный эффект экстракта C. cibarius при вве­дении в первые сутки после инфицирования животных личинками O. felineus. При этом в условиях in vitro и in vivo показано нарушение жизнедеятельности паразитов, визуально выражающееся в увеличении экскреторного пузыря. Наблюдаемый антигельминтный эффект предпо­лагает большую эффективность экстракта на стадии эксцистирования паразита. Отсутствие нарушений динамики массы тела и органов у животных, а также биохимических показателей крови свидетельствует об отсутствии каких-либо побочных эффектов у исследуемого экстракта гри­бов. Необходимо дальнейшее изучение отдельных ком­понентов экстракта C. cibarius с оценкой их антигель­минтных свойств.

Благодарности

Исследование проведено при поддержке РФФИ (грант № 17-04-00790) и бюджетного проекта отделения генетики животных и человека ИЦиГ СО РАН (№ 0324-2018-0016).

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Список литературы / References

Августинович Д.Ф., Вишнивецкая Г.Б., Пирожкова Д.С., Цыга­нов М.А., Вавилин В.А., Пахарукова М.Ю., Шилов А.Г., Дуда­рев В.Г., Мордвинов В.А. Влияние П-(4-метил-3-хлорфенил)-2-ацетокси-3,5-дихлорбензамида на половозрелых и ювенильных особей O. felineus в условиях in vitro и in vivo. Сиб. науч. мед. журн. 2017;37(3):17-26. [Avgustinovich D.F., Vishnivetskaya G.B., Pirozhkova D.S., Tsyganov M.A., Vavilin V.A., Pakharukova M.Y., Shilov A.G., Dudarev V.G., Mordvinov V.A. Influence of N-(4-methyl-3-chlorophenyl)-2-acetoxy-3,5-dichlorobenzamide on adult and juvenile of O. felineus worms in vitro and in vivo. Sibirskyy Nauchnyy Meditsynskyy Zhurnal = The Siberian Scientific Medical Jour­nal. 2017;37(3):17-26. (in Russian)]

Беер С.А. Биология возбудителя описторхоза. М.: Т-во науч. изда­ний КМК, 2005. [Beer S.A. Biology of the Agent of Opisthorchia­sis. Moscow: KMK Publ., 2005. (in Russian)]

Бражникова Н.А., Толкаева М.В. Рак печени, желчных путей и под­желудочной железы при хроническом описторхозе. Бюл. Сиб. медицины. 2002;2:71-76. [Brazhnikova N.A., Tolkaeva M.V. Can­cer of liver, biliary tracts, and pancreas at chronic opisthorchiasis. Bulleten Sibirskoy Meditsyny = Bulletin of Syberian Medicine. 2002;2:71-76. (in Russian)]

Зеленцов А.Г. Восприимчивость линейных мышей к гельминтам. II. Развитие Opistorchis felineus у мышей линий А/Не, CBA/Lac, CC57M/Mv, C57B1/6J, DBA/2J, SWR/J. Мед. паразитология и паразитар. болезни. 1974;43(1):95-98. [Zelentsov A.G. Suscepti­bility of inbred mice to helminths. II. Development of Opisthorchis felineus in mice of strains A/He, CBA/Lac, CC57w/MJ, C57BL/LJ, DBA/2J, and SWR/J. Meditsinskaya Parazitologiya i Parazitarnye Bolezni = Medical Parasitology and Parasitical Diseases. 1974; 43(1):95-98. (in Russian)]

Кукина Т.П., Щербаков Д.Н., Геньш К.В., Тулышева Е.А., Саль­никова О.И., Гражданников А.Е., Колосова Е.А. Биоактивные компоненты древесной зелени облепихи Hippophae rhamnoides L. Химия растит. сырья. 2016;1:37-42. DOI 10.14258/jcprm. 2016011100. [Kukina T.P., Shcherbakov D.N., Gensh K.V., Tulysheva E.A., Salnikova O.I., Grazhdannikov A.E., Kolosova E.A. Bio­active constituents from sea buckthorn Hippophae rhamnoides L. tree green. Khimiya Rastitelnogo Syr’ya = Chemistry of Plant Raw Material. 2016;1:37-42. DOI 10.14258/jcprm.2016011100. (in Rus­sian)]

Пальцев А.И. Хронический описторхоз с позиций системного под­хода. Клиника, диагностика, патоморфоз, лечение. Рус. мед. журн. 2005;2:96-101. [Pal’tsev A.I. Chronic opisthorchiasis from the viewpoint of the system approach: Clinical picture, diagnostics, pathomorphism, and treatment. Russkyy Meditsynskyy Zhurnal = Russian Medical Journal. 2005;2:96-101. (in Russian)]

Проценко М.А., Костина Н.Е., Теплякова Т.В. Подбор питатель­ных сред для глубинного культивирования дереворазрушаю­щего гриба Daedaleopsis tricolor (Bull.) Bondartsev et Singer. Биотехнология. 2018;34(1):45-51. [Protsenko M.A., Kostina N.E., Teplyakova T.V. Selection of nutrient media for submerged cultur­ing of wood-degrading mushroom of Daedaleopsis tricolor (Bull.) Bondartsev et Singer. Biotekhnologiya = Biotechnology. 2018; 34(1):45-51. (in Russian)]

Aina D.A., Jonathan S.G., Olawuyi O.J., Ojelabi D.O., Durowoju B.M. Antioxidant, antimicrobial and phytochemical properties of alcohol­ic extracts of Cantharellus cibarius - a Nigerian mushroom. N. Y. Sci. J. 2012;5(10):114-120.

Avgustinovich D.F., Katokhin A.V., Kontsevaya G.V., Lvova M.N., Vishnivetskaya G.B., Kashina E.V., Marenina M.K., Maksimo­va G.A., Zav’yalov E.V., Mordvinov V.A. A comparative study of Opistrorchis felineus (Rivolta, 1884) infection in inbred C57BL/6 and outbred CD-1 mice. Parasitologiya. 2018;52(1):19-31.

Avgustinovich D.F., Marenina M.K., Zhanaeva S.Y., Tenditnik M.V., Katokhin A.V., Pavlov K.S., Sivkov A.Y., Vishnivetskaya G.B., Lvova M.N., Tolstikova T.G., Mordvinov V.A. Combined effects of social stress and liver fluke infection in a mouse model. Brain Behav. Immun. 2016;53:262-272. DOI 10.1016/j.bbi.2016.01.012.

Avgustinovich D.F., Orlovskaya I.A., Toporkova L.B., Vishnivets­kaya G.B., Katokhin A.V., Lvova M.N., Kashina E.V., Bondar N.P., Feofanova N.A., Mordvinov V.A. Experimental opisthorchiasis: study of blood cell composition, hematopoiesis, and startle reflex in laboratory animals. Russ. J. Genet. Appl. Res. 2017;7(1):82-92.

Charmandari E., Tsigos T., Chrousos G. Endocrinology of the stress response. Annu. Rev. Physiol. 2005;67:259-284. DOI 10.1146/ annurev.physiol.67.040403.120816.

Cieniecka-Rosfonkiewicz A., Sas A., Przybysz E., Morytz B., Syguda A., Pernak J. Ionic liquids for the production of insecticidal and microbicidal extracts of the fungus Cantharellus cibarius. Chem. Biodiversity. 2007;4:2218-2224. DOI 10.1002/cbdv.200790179.

Dechakhamphu S., Pinlaor S., Sitthithaworn P., Nair J., Bartsch H., Yongvanit P. Lipid peroxidation and etheno DNA adducts in white blood cells of liver fluke-infected patients: protection by plasma a-tocopherol and praziquantel. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2010;19(1):310-318. DOI 10.1158/1055-9965.

Ebrahimzadeh M.E., Safdari Y., Khalili M. Antioxidant activity of different fractions of methanolic extract of the golden chanterelle mushroom Cantharellus cibarius (higher basidiomycetes) from Iran. Int. J. Med. Mushrooms. 2015;17(6):557-565. DOI 10.1615/ IntJMedMushrooms.v17.i6.60.

El Enshasy H.A., Hatti-Kaul R. Mushroom immunomodulators: unique molecules with unlimited applications. Trends Biotechnol. 2013; 31(12):668-677. DOI 10.1016/j.tibtech.2013.09.003.

Erko B., Degarege A., Tadesse K., Mathiwos A., Legesse M. Efficacy and side effects of praziquantel in the treatment of Schistosomiasis mansoni in schoolchildren in Shesha Kekele Elementary School, Wondo Genet, Southern Ethiopia. Asian Pac. J. Trop. Biomed. 2012; 2(3):235-239. DOI 10.1016/S2221-1691(12)60049-5.

Greenberg R.M. Schistosome ABC multidrug transporters: From phar­macology to physiology. Int. J. Parasitol. Drugs Drug Resist. 2014; 4(3):301-309. DOI 10.1016/j.ijpddr.2014.09.007.

Keiser J., Adelfio R., Vargas M., Odermatt P., Tesana S. Activity of tribendimidine and praziquantel combination therapy against the liver fluke Opisthorchis viverrini in vitro and in vivo. J. Helminthol. 2013;87(2):252-256. DOI 10.1017/S0022149X12000387.

Khalili M., Ebrahimzadeh M.A., Kosaryan M., Abbasi A., Azadbakht M. Iron chelation and liver disease healing activity of edible mushroom (Cantharellus cibarius), in vitro and in vivo assays. RSC Adv. 2015;5:4804-4810.

Khalili M., Ebrahimzadeh M.A., Omrani F., Karami M. Antihypoxic activities of the golden chanterelle mushroom, Cantharellus cibarius (higher Basidiomycetes). Int. J. Med. Mushrooms. 2014;16(4):339-344.

Kozarski M., Klaus A., Vunduk J., Zizak Z., Niksic M., Jakovljevic D., Vrvic M.M., Van Griensven L.J.L.D. Nutraceutical properties of the methanolic extract of edible mushroom Cantharellus cibarius (Fries): primary mechanisms. Food Funct. 2015;6:1875-1886. DOI 10.1039/c5fo00312a.

Mordvinov V.A., Yurlova N.I., Ogorodova L.M., Katokhin A.V. Opisthorchis felineus and Metorchis bilis are the main agents of liver fluke infection of humans in Russia. Parasitol. Int. 2012;61(1):25- 31. DOI 10.1016/j.parint.2011.07.021.

Muszynska B., Kafa K., Firlej A., Sufkowska-Zlaja K. Cantharellus cibarius - culinary-medicinal mushroom content and biological ac­tivity. Acta Pol. Pharm. 2016;73(3):589-598.

Nair N.N., Bommana A., Pakala S.B., Ohshiro K., Lyon A.J., Suttiprapa S., Periago M.V., Laha L., Hotez P.J., Bethony J.M., Sripa B., Brindley P.J., Kumar R. Inflammatory response to liver fluke Opisthorchis viverrini depends on host-master coregulator, MTA1, a marker for parasite induced cholangiocarcinoma. Hepatology. 2011;54(4):1388-1397. DOI 10.1002/hep.24518.

Nyman A.A.T., Aachmann F.T., Rise F., Balance S., Samuelsen A.B.C. Structural characterization of a branched (1^6)-a-mannan and P-glucans isolated from the fruiting bodies of Cantharellus cibarius. Carbohydr. Polym. 2016;146:197-207. DOI 10.1016/j.carbpol.2016. 03.052.

Pakharukova M.Y., Shilov A.G., Pirozhkova D.S., Katokhin A.V., Mordvinov V.A. The first comprehensive study of praziquantel ef­fects in vivo and in vitro on European liver fluke Opisthorchis felineus (Trematoda). Int. J. Antimicrob. Agents. 2015;46(1):94-100. DOI 10.1016/j.ijantimicag.2015.02.012.

Pinlaor S., Prakobwong S., Boonmars T., Wongkham C., Pinlaor P., Hiraku Y. Effect of praziquantel treatment on the expression of ma­trix metalloproteinases in relation to tissue resorption during fibrosis in hamsters with acute and chronic Opisthorchis viverrini infec­tion. Acta Trop. 2009;111(2):181-191. DOI 10.1016/j.actatropica. 2009.04.011.

Saltykova I.V., Petrov V.A., Logacheva M.D., Ivanova P.G., Merzlikin N.V., Sazonov A.E., Ogorodova L.M., Brindley PJ. Biliary mi­crobiota, gallstone disease and infection with Opisthorchis felineus. PLoS Negl. Trop. Dis. 2016;10(7):e0004809. DOI 10.1371/journal. pntd.0004809.

Sari M., Prange A., Lelley J.L., Hambitzer R. Screening of beta-glucan contents in commercially cultivated and wild growing mush­rooms. Food Chem. 2017;216:45-51. DOI 10.1016/j.foodchem.2016. 08.010.

Sripa B. Pathobiology of opisthorchiasis: an update. Acta Trop. 2003;

88(3):209-220. DOI 10.1016/j.actatropica.2003.08.002.

Sripa B., Bethony J.M., Sithithaworn P., Kaewkes S., Mairiang E., Loukas A., Mulvenna J., Laha T., Hotez PJ., Brindley PJ. Opisthorchia­sis and Opisthorchis-associated cholangiocarcinoma in Thailand and Laos. Acta Trop. 2011;120(1):158-168. DOI 10.1016/j.actatropica. 2010.07.006.

Teufack S.E.N., Tayo G.N.M., Alidou M.N., Yondo J., Djiomene A.F., Pone J.W., Mbida F.M. Anthelminthic properties of methylene chlo­

ride-methanol (1:1) extracts of two Cameroonians medicinal plants on Heligmosomoides bakeri (Nematoda: Heligmosomatidea). BMC Complement. Altern. Med. 2017;17:400. DOI 10.1186/s12906-017-1908-8.

Valverde M.E., Hernandez-Perez T., Paredes-Lopez O. Edible mush­rooms: improving human health and promoting quality life. Int. J. Microbiol. 2015;Art. ID 376387. DOI 10.1155/2015/376387.

Vamanu E., Nita S. Bioactive compounds, antioxidant and anti-inflam­matory activities of extracts from Cantharellus cibarius. Rev. Chim. 2014;65(3):372-379.

Wonkchalee O., Boonmars T., Aromdee C., Laummaunwai P., Khunkitti W., Vaeteewoottacharn K., Sriraj P., Aukkanimart R., Loilome W., Chamgramol Y., Pairojkul C., Wu Z., Juasook A., Sudsarn P. Anti­inflammatory, antioxidant and hepatoprotective effects of Thunbergia laurifolia Linn. on experimental opisthorchiasis. Parasitol. Res. 2012;111(1):353-359. DOI 10.1007/s00436-012-2846-5.

Yurlova N.I., Yadrenkina E.N., Rastyazhenko N.M., Serbina E.A., Glupov V.V. Opisthorchiasis in Western Siberia: epidemiology and dis­tribution in human, fish, snail, and animal populations. Parasitol. Int. 2017;66(4):355-364. DOI 0.1016/j.parint.2016.11.017.