ОТЧЕТ исследования противоописторхозной активности экстракта осиновой коры, экстракта хвойного водного, хвойного концентрата, хвойной пасты

Лечение описторхоза
  1. Введение
  2. Методика проведения эксперимента
  3. Результаты исследований
  4. Заключение
  5. Литература

1. Введение.

1.1 Распространение описторхоза

Описторхоз - это гельминтоз, вызываемый трематодами Opisthorchis felineus, поражающий преимущественно гепатобилиарную систему и поджелудочную железу, отличающийся длительным течением, протекающий с частыми обострениями, способствующий возникновению первичного рака печени и поджелудочной железы [2]. Описторхоз является зооантропонозным заболеванием (зооантропоноз - группа инфекционных и инвазионных болезней, общих животным и человеку). Ареал возбудителя простирается от бассейна Енисея до Западных границ Европы, но распространение заболевания у человека носит очаговый характер. Степень зараженности этим гельминтозом определяется этническими или традиционными особенностями питания и потреблением в пищу необеззараженной рыбы [16]. В странах Юго-Восточной Азии (Таиланд, Лаос, Вьетнам, Камбоджия) имеются очаги описторхоза, вызываемого другим, но очень близким по систематике и биологии сосальщиком - Opistorchis viverrini [19]. Клиника, диагностика, лечение и профилактика заболевания такие же, как вызываемого О. felineus [17]. Кроме того, стремительное развитие туризма и увеличение миграции населения способствуют тому, что случаи заболевания встречаются в странах, для которых описторхоз не является эндемичным - главным образом в США и Канаде [20].

1.2 Этиологические и патогенетические факторы развития, клинические проявления описторхоза

Заражение человека и животных личинками О. felineus в основном происходит при употреблении в пищу сырой, недостаточно термически обработанной, малосоленой или вяленной речной рыбы семейства карповых (язь. плотва, лещ, красноперка и др.) [7]. В настоящее время личинки возбудителя описторхоза выявлены у 26 видов и подвидов рыб на обширном пространстве водоемов западной Европы от Испании и Азии до Восточной Сибири в верховьях Енисея [5].

Клиническая картина описторхоза полиморфна, постоянно происходит чередование периодов обострения болезни и ее латентного течения, что зависит от индивидуальных особенностей организма, эндогенных и экзогенных воздействий, интенсивности и продолжительности инвазий. Наиболее типичными патологическими процессами, ассоциированными с хроническим описторхозом, являются поражения печени, желчевыводящих путей и желчного пузыря, поджелудочной железы и эрозивно-язвенные поражения пищевода, желудка и тонкой кишки [13]. Наблюдаются снижение тонуса желчного пузыря, признаки гипертонуса сфинктера Одди, уменьшение концентрации желчных кислот, уплотнение и увеличение стенки желчного пузыря [1].

Существенные изменения при описторхозе претерпевают ткани печени: отмечаются дистрофия паренхимы печени, а также очаги некроза. При хроническом описторхозе и инфицировании билиарного тракта развиваются «паразитарные» некрозы печени, обусловленные попаданием яиц гельминтов и желчи в паренхиму печени в результате разрыва стенок холангиол. Наряду с деструктивными изменениями слизистой оболочки желчных путей наблюдается резко выраженные регенеративно-гиперпластические (гиперплазия - увеличение числа структурных элементов тканей путём их избыточного новообразования) процессы со стороны покровного эпителия. По мере увеличения интенсивности инвазии нарастают признаки склероза в эпителии желчных протоков [8].

Длительная описторхозная инвазия сопровождается изменениями иммунного гомеостаза, вегетативной нервной системы, а также полиорганным характером патологического процесса [9], так же имеются сведения о росте частоты спонтанных мутаций холангоцитов и гепатоцитов, увеличении количеств хромосомных аномалий в периферических лимфоцитах, повышении количества микро- и биядерных лимфоцитов, происходящих под воздействием паразитов О. felineus и О. viverrini [14].

Изменения в органах обитания паразитов происходит в силу их механического, токсического и вторично-инфекционного воздействия; функционирование нервной системы нарушается вследствие токсического воздействия на ее структуры и выходом из органов паразитирования описторхисов; иммунная система включается в патологический процесс в ответ на воздействие антигенных структур (антигены - структурно чужеродные для данного конкретного организма вещества, способные вызвать иммунный ответ) гельминта и его супрессорного действия [10].

Инвазия О. felineus предрасполагает к развитию панкреатита, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, а также способствует развитию холангокарциномы и рака поджелудочной железы [18]. Хронический описторхоз часто является причиной развития желчнокаменной болезни.

1.3 Лечение описторхоза

В настоящее время арсенал противоописторхозных средств для этиотропного лечения ограничен одним синтетическим препаратом - празиквантелем (билтрицидом ®) [6]. Несмотря на достаточно высокую эффективность, билтрицид обладает широким спектром побочных реакций и имеет ряд противопоказаний, особенно в детской практике. При необходимости прохождения повторного курса препарат можно применять не ранее, чем через год. Часто, из-за развившихся побочных реакций, невозможно проведение повторных курсов лечения билтрицидом. В 36-67 % случаев прием билтрицида вызывает тошноту, рвоту, кожный зуд, сыпь и др. Наблюдаются поражения печени, аллергические миокардиты, панкреонекроз, цитогенетические нарушения.

В комплексной терапии описторхоза и для его профилактики возможно использование БАД противопаразитарного действия. Наибольшей популярностью пользуются «Экорсол» и «Популин» производства ООО «Биолит» (Россия, г. Томск). В их состав входят экстракты осиновой коры и солянки холмовой, которые обеспечивают комплексный подход к лечению описторхоза. Так, экстракт осиновой коры, обладает гельминтоцидным действием, обусловленным фенолгликозидами, производными салигенина - салицином, популином, тремулоиднном, тремулацином, сачикортином. Входящие в состав экстракта дубильные вещества, органические кислоты (бензойная, яблочная, аскорбиновая), горечи, эфирные масла, обеспечивают желчегонный, противовоспалительный, бактерицидный, спазмолитический эффекты, способствуют улучшению аппетита. Экстракт солянки холмовой оказывает гепатопротективный эффект, сопровождающийся восстановлением нарушенных функций печени. Такое сочетание фармакологических свойств делает дегельминтизацию этими БАДами в определенной степени эффективной и безопасной, но значительно более продолжительной по времени по сравнению с курсом лечения билтрицидом. Кроме того, БАДы целесообразно использовать в случаях индивидуальныой непереносимости и других противопоказаний к применению билтрицида, а также при проведении повторных курсов дегельминтизации.

2. Методика проведения эксперимента

2.1 Создание экспериментальной модели описторхоза

Исследование противоописторхозной активности осуществляли на модели хронического описторхоза, рекомендованной Фармакологическим комитетом Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития РФ [15]. В качестве экспериментальных животных использовали золотистых хомяков обоего пола массой 40-45 г, которых содержали в условиях вивария при естественном световом режиме на стандартной диете при свободном доступе к воде и пище.

Метацеркарии описторхов выделяли из рыб карповых пород (преимущественно елец, плотва), выловленной в реке Томь (пос. Аникино Томской области). Оценку зараженности рыбы описторхозом проводили просмотром всей мышечной ткани с помощью микроскопа. Из тела рыбы вырезали мышцы вместе с подкожной клетчаткой на участке справа, напротив спинного плавника. Толщина пласта составляла около 2 мм. Площадь исследуемого участка ограничивалась плавником сверху и боковой линией снизу, по длине - протяженностью плавника. С отпрепарированного пласта соскабливали мышцы и подкожную клетчатку и помещали между двумя стеклами и слегка раздавливали, чтобы толщина слоя была приблизительно равна 0,5-1 мм. Препарат просматривали целиком под бинокулярным микроскопом МБС-10 при увеличении 2 x 12,5.

Из зараженной рыбы, методом переваривания в искусственном желудочном соке, выделяли метацеркарии описторхов. Для этого мышечную ткань рыбы с кожей и подкожной клетчаткой дважды пропускали через мясорубку. Навеску фарша помещали в сосуд с плоским дном и заливали искусственным желудочным соком, состоящим из 11 мл концентрированной хлороводородной кислоты, 7 г пепсина, 9 г хлорида натрия и 1 л воды очищенной. На 100 г фарша использовали 1 л искусственного желудочного сока. Затем сосуд помещали на 18-20 ч в термостат при 37°С.

По истечении указанного времени смесь вынимали из термостата, перемешивали и оставляли на 10-15 мин. Метацеркарии при этом опускались на дно, образуя осадок. Надосадочную жидкость сливали и пептолизат протирали через два слоя марли, смывая физиологическим раствором в высокую мензурку. Через указанное время лишнюю жидкость убирали, затем вновь добавляли физиологический раствор, и смесь вновь оставляли на 10-15 мин. Процесс повторяли 4-6 раз.

Далее осадок помещали на чашку Петри, которую вращали попеременно по и против часовой стрелки таким образом, чтобы в ее центре собирались метацеркарии.

Затем под микроскопом их отбирали микропипеткой и, в количестве по 50 экз. в 0,5 мл изотонического раствора натрия хлорида, вводили внутрижелудочно экспериментальным животным. Клинические проявления заболевания развивались через 30 сут после заражения. У животных наблюдалось облысение волосяного покрова, отмечалась адинамия и агрессивность.

Для более точного подтверждения заболевания проводили контрольное вскрытие нескольких животных. В органах гепатобилиарной системы (печень, желчный пузырь и поджелудочная железа) хомяков было выявлено значительное количество марит описторхов. в связи с чем, констатировали факт развития описторхоза и проводили лечение исследуемыми образцами с последующей оценкой их эффективности.

2.2 Характеристика образцов

2.2.1 Образец «Экстракт осиновой коры» представляет собой коричневый комкующийся, липкий порошок со специфическим запахом, растворимый в воде, умеренно растворимый в этаноле. Получен путем горячей экстракции коры осины водой с последующим упариванием экстракта до порошкообразного состояния [3].

2.2.2 Образец «Экстракт хвойный водный» («Экстракт хвойный натуральный») представляет собой темно-коричневую вязкую жидкость с приятным специфическим хвойным запахом. Смешивается с водой и этанолом. Получен путем водной экстракции древесной зелени сосны и ели с последующим концентрированием [3].

2.2.3 Образец «Хвойный концентрат» («Концентрат провитаминный хвойный») представляет собой оранжевую вязкую массу с характерным хвойным запахом. Не растворим в воде, растворим в этаноле.

2.2.4 Образец «Хвойная паста» («Паста хвойная хлорофилло-каротиновая») представляет собой темно-зеленую вязкую массу с характерным хвойным запахом. Растворим в воде при нагревании, растворим в этаноле. Получен экстракцией бензином хвойной лапки с последующей отгонкой растворителя и щелочным гидролизом [3].

2.3 Введение исследуемых образцов (лечение)

Подопытные животные были распределены на 7 групп по 10 животных в каждой: группа № 1 (интактная) - здоровые животные; группа № 2 (контрольная 1) - животные е описторхозом; группа № 3 (контрольная 2) - животные с описторхозом, получавшие препарат сравнения - билтрицид. Группы № 4, 5, 6, 7 (экспериментальные) - животные с описторхозом, получавшие образцы экстракта осиновой коры, экстракта водного хвойного, хвойного концентрата и хвойной пасты соответственно (табл. 1).

Исследуемые образцы, в зависимости от массы тела животных, вводили внутрижелудочно посредством металлического зонда. Дозы исследуемых образцов подбирали экспериментальным путем, т.к. в источнике [3] отсутствовали данные о величинах LD50. Образцы экстракта осиновой коры и экстракта хвойного водного вводили в дозе 2,0 г/кг массы животного три раза в день в течение трех дней в виде суспензии в 1% крахмальной слизи [И, 12]. Указанная доза и схема введения обычно применяются при проведении скрининговых исследований противоописторхозной активности образцов растительного происхождения.

Введение образцов хвойного концентрата и, в особенности, хвойной пасты по аналогичной схеме вызвало у животных существенные токсические эффекты. Так, после первого дня введения хвойного концентрата, у животных наблюдались: полная адинамия, рвота, судороги, повышенная потливость, отсутствие аппетита, частый жидкий стул. В экспериментальной группе хвойной пасты отмечена 100% летальность. При вскрытии этих животных в брюшной полости обнаружено значительное скопление экссудата.

Дальнейшее введение образцов хвойного концентрата и хвойной пасты проводили два раза в день в течение трех дней в дозах 0,35 г/кг и 0,15 г/кг массы животного соответственно. В данном эксперименте использованы дозы, аналогичные дозам при исследовании антиканцерогенных свойств указанных образцов [3]. Схема введения идентична схеме введения образцов 1 и 2. Концентрат хвойный не суспендируется в 1% крахмальной слизи, поэтому его вводили в виде суспензии в персиковом масле. Образец хвойной пасты вводили в виде суспензии в 1% крахмальной слизи.

В качестве препарата сравнения использовали билтрицид (празиквантель), т.к. на сегодняшний день он является единственным официнальным лекарственном средством для лечения этого заболевания. Билтрицид вводили в виде суспензии в 1 % крахмальной слизи в дозе 20 мг/кг массы животного двукратно в течение одного дня. Учитывая значительную токсичность данного препарата, указанные доза и схема введения максимально безопасны и эффективны при лечении описторхоза экспериментальных животных, вызванного О. felineus [4,11].

2.4 Учет результатов (расчет коэффициента интенс-эффективности)

Латентный период после окончания курсового введения исследуемых образцов составил 14 дней. В течение указанного времени происходит естественное выведение марит описторхов, утративших жизнеспособность в результате лечения. По истечении указанного срока животных усыпляли в герметичной камере с углекислым газом и производили их вскрытие. Из брюшной полости извлекали печень с желчным пузырем и поджелудочную железу, которые подвергали анатомическому исследованию на предмет наличия марит описторхов. Из пузырной желчи их выделяли путем прокола желчного пузыря, а из желчных ходов печени и поджелудочной железы - путем выдавливания.

Затем по формуле 1 рассчитывали коэффициент интенс-эффективности (ИЭ), который является критерием противоописторхозной активности [15]:

ИЭ = К - О/К x 100%; (1)

где К - среднее число марит описторхов в группе № 2 (контрольная 1);
О - среднее число марит описторхов в экспериментальной группе.

Полученные результаты исследований подвергнуты математической обработке методом дескриптивной статистики по критерию Стьюдента с использованием пакета программного обеспечения Statistica 6.0.

3. Результаты исследований.

Полученные данные, подвергнутые статистической обработке, представлены в таблице.

Из таблицы видно, что наибольшей противоописторхозной активностью обладает образец хвойной пасты: коэффициент ИЭ составил 54,3% (табл.). Образец экстракта водного хвойного проявил несколько меньшую активность - ИЭ = 46,7 %. Экстракт осиновой коры в исследованной дозе оказал наименьший противоописторхозный эффект.

Мед. Университета, в значительно меньшей дозе и в кратчайшие сроки - в течение 3 дней при приеме 2-3 раза в день. Экстракт не дает побочного эффекта.

Указанные в таблице дозы необходимы и достаточны. Снижение дозировки экстракта не даст желаемого противогельминтного действия. Многократное увеличение дозы в сутки приводит к отрицательному действию. Однако с учетом того, что это пищевые продукты, которые в малых дозировках (0,1 г 1-3 раза в день) применяются в качестве БАД длительными курсами для восполнения дефицита полезных компонентов пищи (витаминов, микронутриентов), профилактическая ценность экстракта многократно возрастает. Важно, что вполне можно обойтись без билтрицида – фармпрепарата с побочным эффектом.

Примечание: пересчет доз препаратов с экспериментальных животных на человека проводили по формуле:

1

Р.д. билтрицида = 20x5,2/37,0 = 2,81 мг/кг (или 0,00281 г/кг х 60 = 0,16 г на один прием);

Р.д. экстрактов осины и хвойного водного = 2000x5,2/37,0 = 271,08 мг/кг (или 0,28108 г/кг х 60 — 16,86 г на один прием);

Р.д. хвойного концентрата = 350x5,2/37,0 - 49,19 мг/кг (или 0,04919 г/кг х 60 = 2,95 г на прием);

Р.д. хвойной пасты = 150x5,2/37,0 = 21,08 мг/кг (или 0,02108 г/кг х 60 = 1,26 г на прием).

Таблица - Схемы введения и значения ИЭ исследуемых образцов

Группа животных

Доза, схема введения

ИЭ, %

ИЭ в сравнениие билтрицидом, %

Группа № 1 (n =10): интактные животные

-

-

-

Группа№ 2 (контрольная 1; n =10): животные с описторхозом

-

-

-

Группа № 3 (контрольная 2; n =10); препарат сравнения (билтрицид)

0,02 г/кг двукратно в течение одного дня

65,6 ±6,2%

-

Экспериментальная группа № 4 (n =10): экстракт осиновой коры

2,0 т/кг три раза в день в течение трех дней

12,7 ± 4,4

19,3

Экспериментальная группа № 5 (n =10): экстракт хвойный водный

46,7 ± 4,0

71,2

Экспериментальная группа № 6 (n =10): хвойный концентрат

0,35 г/кг два раза в день в течение трех дней

17,4 ±5,6

26,5

Экспериментальная группа № 7 (n=10): хвойная паста

0,15 г/кг два раза в день в течение трех дней

54,3 + 6,9

82,7

Примечание:n - количество животных в группе.

4. Заключение.

В результате проведенных испытаний, все исследуемые образцы, полученные из биомассы дерева, проявили целевую активность, но в различной степени. Наиболее перспективными для дальнейших исследований по тематике описторхоза является хвойная паста и хвойный водный экстракт, т.к. в эксперименте in vivo они проявили наибольший эффект, составляющий не менее 70% от суммарной активности препарата сравнения, билтрицида. Кроме того, этот эффект достигнут при использовании минимальных доз. Так, доза хвойного концентрата меньше доз образцов 1 и 2 примерно в 5,7 раз. Образцы экстрактов осиновой коры и хвойного концентрата в исследованных дозах гораздо менее эффективны, но можно ожидать, что при увеличении курса лечения в 2-3 раза, их эффективность возрастет.

Зав. каф. фармацевтической химии ГОУ ВПО СибГМУ (г.Томск), д.ф.н., проф. Краснов Е.А.
Ассистент каф. фармацевтической химии ГОУ ВПО СибГМУ, к.ф.н. Каминский И.П.

Литература
1. Белобородова, Э. И. Хронический описторхоз и пищеварительная система / Э. И. Белобородова, М. И. Калюжина, Ю. А. Тиличенко, Т, А. Колосовская // Сибир. жури, гастроэнтер. и гепатол. - 1995. - Хе 1. - С. 4-8.
2. Белозеров, Е. С. Описторхоз / Е. С. Белозеров, Е. П. Шувалова. - Л. : Медицина. Ленинградское отделение, 1981. - 128 с.
3. Беспалов В. Г. Лечебно-профилактические средства из биомассы дерева / В. Г. Беспалов, В. Б. Некрасова. - СПб. : Изд-во Политехи, ун-та, 2007. - 192 с.
4. Бронштейн, М. А. Трематодозы печени: описторхоз, клонорхоз / М. А. Бронштейн, В. И. Лучшее // Русский медиц. журн. - 1998. - Т. 6, Х° 3. - С. 140-148.
5. Бычкова, Н. К. Описторхидозы человека в российских нозоареалах (обзор литературы) / Н. К. Бычкова, В. Д. Завойкин, О. П. Зеля // Сибир. вести, гепатол и гастроэнтер. - 2007. - N ° 21. - С. 6-8.
6. Завойкин, В. Д. Тактика широкого применения празиквантеля в комплексе мер борьбы с описторхозом. 3. Общие подходы к амбулаторному лечению больных описторхозом в очагах / В. Д. Завойкин, О. П. Зеля, Μ. М. Михайлов, В. В. Брагин // Мед. паразитол. и паразитар. болезни. - 2001. - Х«2. - С. 13-17.
7. Ильинских, Е. Н. Актуальные вопросы изучения описторхоза в Сибири / Е. Н Ильинских // Бюлл. сибир. медиц. - 2002. -Х° 1. - С. 63-69.
8. Ильинских, Е. Н. Патогенетические изменения печени при описторхозной инвазии / Е. Н. Ильинских // Акт. вопр. медиц. биол. - 2002. - №3 - С. 135-137.
9. Калюжина, Е. В Соотношение интерлейкинов (ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-6) и пнтерферона-Г у больных хроническим гломерулонефритом на фоне хронического описторхоза / Е. В. Калюжина, О.Ф. Сибирева, М. И. Калюжина, И. К. Лавщиц Н Сибир. вестн. гепатол. и гастроэнтер. - 2009. - №23. - С. 51-53.
10. Калюжина, Е. В. Состояние иммунитета у больных хроническим гломерулонефритом на фоне описторхозной инвазии / Е. В Калюжина, Л. И. Зибницкая, Ю. Д. Пак, Н. Г. Юнеман, О. А. Серегина, Л. Г. Суркова // Сибир. журн. гастроэнтер. и гепатол. - 2002. -№14.-С. 122-123.
11. Каминский, И, П. Исследов ание противоописторхозной активности василька шероховатого / И. П. Каминский, Э. В. Сапрыкина, Е. А. Краснов, Т. В. Кадырова, Е. А. Аносова // Вопр. биол., медиц. и фармацевт, химии. - 2010. - X® 8 - С. 20-24.
12. Мефодьев, В. В. Противоописторхозная активность препаратов из растительного сырья флоры Сибири / В. В. Мефодьев, Е. А. Краснов, В. А. Майер, В. В. Дудко, Л. В. Крыласова, И. И. Балашова, Н. К. Бычкова, А. В. Лепехин, Т. А. Созонова, Н. В. Харитонова // Описторхоз. Соврем, состояние проблемы, перспективы развития : матер, юб. конф. - Тюмень, 1991. - С. 148-151.
13. Непомнящих, Г. И. Псориаз и описторхоз: морфогенез гастроинтестинопатии / Г. И. Непомнящих, С. А. Хардикова, С. В. Айдагулова, Г.А. Лагшй. - М.: Российская академия медицинских наук - 2003. - 175 с,
14. Осипенко, Μ. Ф. Описторхозная инвазия. Основные подходы к терапии / Μ. Ф. Осипенко, Η. Н. Фролова, В. К. Чердынцева, Л. Ю. Панкова, Н. В. Литвинова // Болезни органов пищеварения. - 2003. - № 2. - С. 14-17.
15. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общ. ред. чл-кор. РАМН, проф. Р. У. Хабриева. 2-е ИЗД.-М., 2005.-С. 615-636.
16. Сергиев, В. П. Паразитарные болезни сегодня и завтра / В. П. Сергиев // Качество жизни. Медицина. - 2005. - № 1. - С. 10-15.
17. Mairiang, Е. Clinical manifestation of opisthorchiasis and treatment / E. Mairiang, P. Mairiang // Acta tropica. - 2003. - N 88. - P. 221-227.
18. Schistosomes, liver fluckes and Helicobacterpilori. IARC monographs on evaluation of cancerogenic risk to humans. Lion : IARC, 1994. - Vol. 61. - 278 p.
19. Upatham, E. S. Opisthorchis viverrini and opisthorchiasis: a historical review and future perspective / E. S. Upatham, V. Viyanant // Acta tropica. - 2003. - N 88. - P. 171-176.
20. Yossepowitch, O. Opisthorchiasis from Imported Raw Fish / O. Yossepowitch, T. Gotesman, M. Assous, E. Marva, R. Zimlichman, M. Dan // Emerging infectious diseases. - 2004. - Vol. 10, N 12. - P. 132-139.

Написать комментарий [отменить ответ]

Внимание: HTML разметка не поддерживается!!

Статьи по теме:

Все статьи раздела