Биологическое действие эффективных микроорганизмов (обзорная статья)

Блинов В. А.,
доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой биотехнологии, органической и биологической химии,

Буршина С. Н.,
кандидат биологических наук, доцент,

Шапулина Е. А., кандидат биологических наук ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н. И. Вавилова», кафедра биотехнологии, органической и биологической химии

1. Введение

По данным медицинской статистики, треть человечества ежегодно подвергается инфекционным заболеваниям. Одновременно постоянно увеличивается число и разнообразие возбудителей этих болезней: бактерии, вирусы, грибы и т. д. Лишь в последние годы зарегистрировано около 30 новых возбудителей болезней, среди которых лихорадки Эбола и Марбург, легионеллез, ротавирусные инфекции и другие. Эпидемиологическая обстановка осложняется появлением все новых штаммов микроорганизмов, обладающих устойчивостью к самым современным лекарственным средствам.

Выход из сложившейся ситуации может быть лишь один — широкое использование второй части микромира, то есть использование микроорганизмов, которые, с одной стороны, непатогенны, с другой — антагонистичны болезнетворным биообъектам. В этом отношении сделаны лишь первые шаги, хотя хорошо известно, что нормальная микрофлора играет огромную роль в поддержании здоровья. Так, на поверхности кожи и слизистых оболочек существует биопленка, которая активно участвует во взаимоотношениях организма хозяина и внешней среды. Функции микроорганизмов такого «биопокрытия» чрезвычайно многообразны: регуляция работы кишечника, участие в метаболизме протеинов, жиров, углеводов, наработке биологически активных соединений (витаминов, аминокислот, ферментов), нейтрализация токсинов и т. д. Кроме того, нормальная микрофлора противодействует многим возбудителям заболеваний, защищая почву, растения, животных и человека от патогенных микроорганизмов.

Именно такой микрофлорой, обладающей отчетливо выраженными регенеративными свойствами, являются микроорганизмы, составляющие суть новых микробиологических препаратов и ЭМ-технологий на их основе. До недавнего времени микробиологами отвергалась возможность создания культуры, в которой были бы соединены несовместимые микроорганизмы, то есть те, которые просто уничтожали бы друг друга. Однако ЭМ-технологии удалось совместить несовместимое: был создан консорциум эффективных микроорганизмов (ЭМ), включающий как аэробные, так и анаэробные разновидности биообъектов. Иными словами, была найдена большая группа организмов, которые могут сосуществовать в смешанных культурах и физиологически совместимы друг с другом. При внедрении таких микроорганизмов в естественную окружающую среду их индивидуальные позитивные качества за счет синергизма существенно увеличиваются.

ЭМ-культуры не содержат генетически измененных микроорганизмов, они составлены из тех бактерий, дрожжей, грибов, БАВ, которые имеются в естественной среде во всем мире.

ЭМ-технология является единственной современной технологией, которая охватывает все области АПК: почва, растения, животные, переработка сельскохозяйственного сырья, получение экологичной продукции.

ЭМ-технология широко применяется во многих странах, в том числе и в России. Однако механизмы действия эффективных микроорганизмов на уровне целого организма, а тем более на клеточном и молекулярном уровнях, практически не разработаны. Некоторые из таких результатов, полученных при исследовании почвы, растительных и животных систем, представлены в обзоре.

2. Технология эффективных микроорганизмов

Широкое внедрение в сельскохозяйственное производство механизации (глубокая обработка почв, мелиорация и др.) и химизации (минеральные удобрения, различные ядохимикаты) оказало негативное влияние на свойства почвы (структура, водопроницаемость, аэрация, уменьшенная подвижность N , P , K ), количество и качество производимой продукции, окружающую среду и здоровье людей. Настало время изменить действующее агрохимическое направление на агробиологическое.

Суть концепции биологического (в России применяется термин «экологичное земледелие») земледелия состоит в том, чтобы широко внедрить в сельское хозяйство поверхностную обработку почвы, разумно использовать минеральные удобрения, обращая особое внимание на приумножение в почве количества бактерий, червей и прочего «живого вещества». В результате существенно снизятся расходы на производство дорогостоящей сельскохозяйственной техники, горюче-смазочные материалы, будет облегчен труд землепашца, восстановлено нарушенное химикатами сельское хозяйство и решена проблема продовольственной безопасности России.

При экологичном земледелии почва поддерживается в активном, жизнедеятельном состоянии благодаря, главным образом, микрофлоре. Она обеспечивает культивируемые растения элементами питания за счет ферментации растительных остатков, органических удобрений, гумуса и извлечения элементов из минералов почвы. Эффективность микроорганизмов почвы весьма существенна за счет высокого соотношения их поверхности и объема, интенсивного дыхания и огромного количества: в 15сантиметровом слое почвы на 1 га находится более 5 т грибов и бактерий.

Микробные препараты нового поколения отличаются сложным качественным и количественным составом, комплексностью действия на растения и животных, эффективностью поддержания почвы в биологически активном состоянии, что обеспечивает ее высокое плодородие. Сейчас биопрепараты широко применяют для силосования кормов, в качестве биодобавок для улучшения качества кормов, повышения сохранности молодняка, резистентности сельскохозяйственных животных и птицы к различным заболеваниям и неблагоприятным факторам внешней среды, обезвреживания отходов сельского хозяйства, их более полной переработки. Они альтернативны использованию пестицидов и удобрений.

В настоящее время специфические микробные популяции используются достаточно широко. Например, бактерии применяются для борьбы с гусеницами, комарами и мошкой, микробные препараты успешно избавляют почву от сорняков. Молочнокислые бактерии оказываются эффективными в птицеводстве и свиноводстве для лечения стрессовых диарей, бактериальных, вирусных заболеваний тонкого кишечника (В. А. Юрченко, 2001; Н. Г. Громова, 2001; А. В. Гулей, 2001; А. В. Данильченко, 2001 и др.).

ЭМ-технология базируется на использовании смешанных непатогенных, позитивных микроорганизмов, обитающих в естественных условиях.

Применение микробиологического препарата «Байкал ЭМ1» в животноводстве и растениеводстве обеспечивает:

Животноводство:

• снижение падежа телят, ускорение их роста и развития, повышение резистентности к различного рода заболеваниям, увеличение привеса и удоя коров, улучшение качества мяса, повышение плодовитости скота, уменьшение напряжения (стресса) животных, подавление неприятных запахов в хлеве и сборниках нечистот, уменьшение количества мух и клещей, улучшение качества навоза, который быстро становится удобрением; уменьшение использования лекарственных препаратов;
• снижение падежа поросят, повышение их стойкости к кишечным заболеваниям, улучшение внешнего вида, увеличение привесов, лучшее переваривание пищи, существенное повышение рентабельности производства;
• снижение падежа цыплят, увеличение их живой массы, меньшее потребление кормов за счет их лучшего усвоения, усиление биосинтеза белка, повышение стойкости иммунной системы и улучшение функционального состояния печени;
• эффективное ферментирование кормов, увеличение усвояемости кормов.

Растениеводство:

• ускорение прорастания семян, обеспечение дружности всходов, ускорение цветения, плодоношения и созревания растений;
• повышение урожайности зерновых, овощных и сидераль- ных культур;
• микробиологические препараты оказывают положительное влияние при силосовании;
• повышение устойчивости растений к весенним и осенним заморозкам;
• повышение содержания витаминов;
• увеличение сроков хранения плодоовощной продукции;
• микробиологические препараты и технологии на их основе улучшают физические, химические и биологические свойства почвы, переводят почвенные микро- и макроэлементы в легкоусвояемые формы, ускоряют образование гумуса, подавляют развитие почвенных болезнетворных микроорганизмов и вредителей, восстанавливают плодородие почвы (Коровяков И., Хига Т., Шаблин П. А., 2001).

Хорошо известно, что любые нововведения, какими бы они ни были привлекательными, требуют для их восприятия времени, твердо установленных фактов, причем полученных в разных коллективах и научных школах. Безусловно, что ЭМ-технология как часть доктрины экологичного земледелия приоритетна и инновационна. По нашему мнению, это обусловлено тем, что ЭМ-технология:

• Представляет конкретный инструмент эволюционно обоснованного, биологически оправданного повышения плодородия почвы.
• Использует микроорганизмы, не подвергнутые генно-инженерным модификациям, а являющиеся привычной микробиотой, к которой адаптированы организмы человека и животных, сосуществующие с ней многие тысячи лет.
• Позволяет использовать поликомпонентные микробиологические препараты для выращивания многих сельскохозяйственных культур.
• Открывает новый подход к эволюционно детерминированной, неразрывной взаимосвязи непатогенных микроорганизмов и макроорганизмов всех уровней биосферы. Это определяет большие потенциальные возможности использования ЭМ-технологии не только в АПК, но и в других областях хозяйственной деятельности людей.
• Кризис биосферы привел природу в состояние, которое угрожает существованию человечества. В такой ситуации новый подход, основанный на внедрении микробиологических препаратов и технологий на их основе, будет способствовать решению кажущихся неразрешимыми проблем сельского хозяйства, восстановлению нарушенных экосистем, плодородия почвы, обеспечению людей высококачественной экологичной продукцией растениеводства и животноводства (Блинов В. А., 2003).

Итак, несмотря на существенную эффективность ЭМ-технологии в улучшении плодородия почвы, повышении урожайности зерновых, овощных культур, пищевой зелени, плодовых и кустарниковых растений, увеличении продуктивности сельскохозяйственных животных (крупный рогатый скот, свиньи) и птицы, механизм действия эффективных микроорганизмов на организ- менном, органном, клеточном и молекулярном уровнях совершенно не изучен. Между тем раскрытие таких механизмов является актуальным и позволит понять значение новых микробиологических препаратов группы ЭМ для растений и животных и на этом основании усовершенствовать технологию применения этих препаратов для различных сельскохозяйственных культур и видов животных. Это также позволит создать новое поколение препаратов с улучшенными свойствами.

В задачи исследования входило:

• Разработать методы определения активности препарата «Байкал ЭМ1».
• Изучить влияние эффективных микроорганизмов на транспорт углеводов в ткани.
• Изучить цитологические механизмы действия эффективных микроорганизмов.
• Изучить влияние эффективных микроорганизмов на свойства и активность некоторых ферментов растительных и животных тканей.

Необходимость проведения исследований обоснована тем, что пробиотики группы ЭМ в настоящее время широко внедряются в различные области сельского хозяйства. Однако механизм их действия практически неизвестен, что не позволяет дифференцированно разрабатывать научно-обоснованные технологии для применения препаратов этой группы в растениеводстве и животноводстве, а также оценить их влияние на молекулярном и цитологическом уровне на организм растений и животных.

3. Физико-химическая характеристика микробиологических препаратов серии ЭМ и методы определения их активности

В России с 1998 г. применяется, главным образом, отечественное микробиологическое удобрение «Байкал ЭМ1», созданное на базе микроорганизмов байкальской экосистемы. На его основе созданы препараты «Тамир», «Урга», ЭМ-5, удобрение «Ургаса», закваска сухая для производства кисломолочного напитка «ЭМ-Курунга».

Микробиологические препараты «Байкал ЭМ1» и «Тамир»

Нами впервые в сравнительном аспекте изучены физико-химические, биохимические и морфологические свойства препаратов «Байкал ЭМ1» и «Тамир».

Приведем сначала данные по препарату «Байкал ЭМ1». Установлено, что плотность препарата, относительная и кинематическая вязкость, показатель преломления не отличаются от показателей воды. Определение ИК-спектра позволяет считать, что в препарате «Байкал ЭМ1» содержится незначительное количество органического вещества (микроорганизмов), которое по своей природе не гомогенно, а разнородно.

По нашим данным, поверхностное натяжение препарата составляет 69,6 дин/см, оно почти не изменялось при разведениях (1:100 и 1:1000) и соответствовало воде (73,5 дин/см).

рН препарата составляет 3,38±0,13, при первом разбавлении— 4,90±0,25 (Р<0,001), при втором — 6,53±0,13 (Р<0,001). В то же время препарат обладает достаточно высокой титруемой кислотностью (25,7±0,42). При разведении 1:100 титруемая кислотность снизилась почти в 25 раз, а при разбавлении 1:1000 — в 50 раз. Эти данные свидетельствуют о незначительной буферной емкости препарата эффективных микроорганизмов. Затем это предположение было подтверждено прямым путем. Оказалось, что буферная емкость препарата составляла всего 0,033±0,004 г-экв.

Как известно, в изоэлектрическом состоянии свойства растворов резко изменяются. Они при этом приобретают наименьшую вязкость, что связано с изменением формы макромолекул. При значении рН, близком к изоэлектрической точке, разноименно заряженные группы NH 3+ и СОО притягиваются друг к другу, и нить белка закручивается в спираль. При смещении рН среды от изоэлектрической точки одноименно заряженные группы отталкиваются, и цепь белка выпрямляется. Молекулы в развернутом состоянии придают растворам более высокую вязкость, чем молекулы, скрученные в спираль. Полученные нами данные по определению изоэлектрической точки препарата «Байкал ЭМ1» представлены на рисунке 1.

Рис. 1. Изоэлектрическая точка препарата «Байкал ЭМ1»

Как следует из этого рисунка и проведенных математических расчетов, изоэлектрическая точка препарата составляет 5,3.

В последующем мы определили некоторые биохимические параметры препарата «Байкал ЭМ1», а также его рабочих растворов. Нами было установлено, что содержание белка в препарате незначительно и составляет 2,55±0,19 г/л.

Концентрация мочевины в препарате была равна 10,043±0,45 ммоль/л, а аммиака и глутамина соответственно 0,028±0,002 и 0,010±0,0 мкмоль/л.

Что касается глюкозы, то ее содержание оказалось в препарате весьма высоким и составляло 27,41±1,50 ммоль/л.

Напротив, уровень молочной кислоты оказался низким 0,57±0,02%.

Важными гликопротеинами являются сиаловые кислоты. Нами установлено, что в препарате содержание сиаловых кислот составляло 95,0±0,8 усл.ед. Их концентрация резко, в 9,5 раза, снизилась при разбавлении препарата 1:100 и уменьшилась в 17 раз при разбавлении препарата 1:1000. Исходя из полученных данных, можно считать, что исследование сиаловых кислот может быть одним из достоверных методов определения активности и качества препарата.

Значительный объем работы был выполнен нами при изучении активности ферментов в препарате. Установлено, что в препарате «Байкал ЭМ1» активность амилазы составляет 128±0,0 ед. Активность АсАТ (0,805±0,04 мккат/л) всегда была несколько выше активности АлАТ (0,793±0,01 мккат/л), а коэффициент де Ритиса (отношение АсАТ к АлАТ) составил 1,02.

Подводя итоги биохимическим исследованиям препарата «Байкал ЭМ1», следует подчеркнуть, что в нем имеется сравнительно небольшое количество белка, весьма высокое содержание глюкозы и мочевины, которые могут выступать в качестве консервантов. Изменение содержания конечных продуктов азотистого обмена, особенно аммиака, свидетельствует о том, что микрофлора препарата метаболизирует слабо. Гликолитическая активность микроорганизмов препарата также, видимо, незначительная, ибо содержание молочной кислоты в нем оказывалось небольшим. В препарате, который сертифицировался, нами впервые зарегистрирована активность амилазы, аспартат — и алани- наминотрансфераз.

Бактериальные клетки препарата «Байкал ЭМ1» имели следующие морфологические признаки, которые были установлены микроскопически. В нем обнаружены короткие и длинные палочки. Некоторые из них закруглены на конце. Кроме того, определялись кокки с беспорядочным расположением клеток.

Что касается препарата «Тамир», то плотность, вязкость, поверхностное натяжение и показатель преломления этого препарата почти не отличались от соответствующих характеристик воды. рН «Тамира» была 3,23±0,06. При разбавлении в 100 раз эта величина вследствие того, что рН исследуемой воды была равна 7,0, повысилась до 4,38±0,02, а в 1000 раз — до 6,50±0,25.

Препарат обладал высокой титруемой кислотностью — 64,3±0,84, которая при первом разбавлении снижалась в 43 раза, а при втором — в 64 раза.

Буферная емкость препарата «Тамир» была незначительной и составляла 0,045±0,005 г-экв, а его изоэлектрическая точка равнялась 5,0.

Как установлено далее, в препарате содержание общего белка составило в среднем 7,0±1,0б г/л, мочевины —11,43±0,99 ммоль/л, аммиака — 0,038±0,002 мкмоль/л, глутамина — 0,012±0,002 мкмоль/л.

Из показателей углеводного обмена нами в препарате «Та- мир» определялись глюкоза, молочная кислота и сиаловые кислоты. Их концентрация была равна соответственно 27,16±0,66 ммоль/л, 0,63±0,0016% и 55,0±0,8 усл. ед. Активность амилазы в препарате «Тамир» составляла 256±1,0 ед, АсАТ — 0,84±0,04 мккат/л, АлАТ — 0,77±0,02 мккат/л, а коэффициент де Ритиса — 1,09.

При микроскопии в препарате обнаружены палочки разной длины, клетки круглые, зернистые. Колонии неподвижные.

Таким образом, впервые сертифицированные нами препараты эффективных микроорганизмов действительно относятся к одной серии ЭМ и, несмотря на различное их назначение, отличаются между собой лишь по некоторым показателям (титруемая кислотность, содержание белка, сиаловых кислот, активность амилазы, количество бактериальных клеток в 1 мл препарата).

Методы определения активности препаратов серии ЭМ

Препараты серии ЭМ представляют собой сложный консорциум различных микроорганизмов. Поэтому определение активности препарата «Байкал ЭМ1» является весьма трудной задачей, которая дополнительно усложняется тем, что производитель не раскрывает их истинного состава. Определение активности любого микробиологического препарата необходимо как для установления его подлинности, так и для выбора дозировок при выращивании сельскохозяйственных культур или для повышения продуктивности животных и птицы.

Нами для определения активности препарата «Байкал ЭМ1» использовано два подхода.

Оценка субстратной активности препарата «Урга» («Байкал ЭМ1»)

В этих экспериментах объектом исследования служил коммерческий зерновой мицелий шампиньонов. На чашки Петри с твердой агаризованной средой (2% агара и 2% муки) инокулиро- вали мицелий. Каждую чашку Петри разделяли на две части, одна из них служила контролем, а вторая — опытом. В опытные части чашек к зерновому мицелию добавляли препарат в количестве 0,5 мл, но в различных разбавлениях.

В таблице 1 приведены данные на 9 день опыта. Из них следует, что препарат усиливал рост мицелиальных гиф, что прямо коррелировало с более быстрым образованием плодовых тел.

Энергия прорастания усиливалась под влиянием всех доз препарата, но наиболее значительно — при разбавлении 1:1500. Наконец, самое существенное. Толщина питательной среды в чашках Петри составила 4 мм. Через 9 дней после введения препарата «Байкал ЭМ1» она уменьшилась при всех разбавлениях, но наиболее значительно — при разбавлении 1:250 (на 61,9%). Из этих данных следует, что препарат способен усиливать потребление питательных веществ (субстрата) мицелием шампиньона. Аналогичное, хотя и несколько менее выраженное, литическое действие препарата «Урга» («Байкал ЭМ1») было характерно и для других, меньших, концентраций препарата. Следовательно, об активности препарата можно судить по степени потребления полисахаридного субстрата.

Влияние препарата «Урга» («Байкал ЭМ1») на мицелий шампиньона

Таблица 1

 

Показатели	Контроль	Разбавления
		1:250	1:500	1:1000	1:1500
Размер гиф, мм	4,6±0,4	5,6±0,7	4,9±0,3	5,7±0,6	6,7±0,2
Энергия прорастания, %	96,9	97,6	97,1	98,5	99,3
Степень потребления среды, мм	3,4±0,2	2,1±0,2	2,7±0,1	2,7±0,1	2,6±0,1

Способ оценки активности препарата «Байкал ЭМ1» по посевным качествам семян

Известно несколько способов повышения низких посевных качеств семян с помощью бактерий. Основными недостатками их являются: необходимость использования разных препаратов микроорганизмов, сложная технологическая схема получения экстракта и культуральной жидкости этих микроорганизмов, невысокая прибавка урожая и так далее.

Нами предложен способ, основанный на сравнении семян, имеющих разные посевные качества (таблица 2).

Под влиянием различных разбавлений препарата «Байкал ЭМ1» (1:500; 1:1000 и 1:2000) посевные качества семян ячменя существенно улучшались, особенно при использовании разбавления 1:2000. Эти данные представлены на рисунке 2 и в таблице 3.

Исходные посевные качества семян яровой пшеницы и ячменя (М±т)

Таблица 2

 

Группа Всхожесть, % Энергия прорастания, % Дружность прорастания, % Скорость прорастания, сутки Длина в мм на 7-е сутки корня ростка Пшеница «Саратовская 55» 95,9±1,1 94,9±1,2 37,4±3,9 1,1±0,1 84,3±4,2 63,4±3,7 Ячмень «Волгарь» 27,2±3,9 26,8±3,6 1,6±0,2 9,5±1,6 68,5±3,8 54,6±2,6 р <0,001 <0,001 <0,02 <0.001 <0,01 <0,05

 

Рис. 2. Изменение посевных качеств семян ячменя

Таблица 3

Влияние препарата «Байкал ЭМ1» на семена ячменя с низкими посевными качествами (в % к контролю)

 

Влияние обработки семян	Всхожесть	Энергия	Дружность	Скорость	Длина
		прорастания	прорастания	прорастания	корня	ростка
Контроль (вода)	100	100	100	100	100	100
Разбавление препарата:
1:500 1:1000 1:2000	98	97	94	116	92	109
	127	125	98	107	107	119
	134	134	94	119	115	205

Использование разработанного нами способа позволяет не только оценивать активность препарата «Байкал ЭМ1», но и повысить посевные качества семян, исходный уровень которых по всхожести, энергии и дружности прорастания был весьма низким. Это открывает новые перспективы применения в различных областях сельского хозяйства семян с низкими предпосевными свойствами, а также залежалых, длительно не использованных, в том числе фуражных семян. По результатам указанных исследований в Роспатент подана заявка №2003122580/13 (023735) на «Способ предпосевной обработки семян с низкими посевными качествами».

4. Цитологические эффекты препаратов серии ЭМ Мутагенное действие препарата «Байкал ЭМ1»

Препарат «Байкал ЭМ1» изучен по системе GLP (Good Laboratore Practicae), отвечающей требованиям Государственной Фармакопеи. На белых лабораторных мышах была определена его токсичность, пирогенность, мутагенность, тератоген- ность, изучено влияние на картину периферической крови, важнейшие биохимические показатели и морфологическое состояние внутренних органов при вскрытии животных. Кроме того, мы оценивали внешний вид подопытных мышей, их живую массу, состояние мочеиспускания, акта дефекации, поведенческие реакции, потребление корма и воды.

Препарат «Байкал ЭМ1» в острых и хронических опытах не вызывал у мышей повышения температуры тела и видимых уродств во втором поколении, то есть препарат не обладал пирогенным и тератогенным действием. Оценку мутагенного влияния препарата проводили методом подсчета аномальных головок сперматозоидов. Для этого мышам однократно вводили внутрижелудочно препарат в дозе 1 мл и через три дня оценивали выход максимального числа поврежденных сперматозоидов. Число аномальных головок сперматозоидов у самцов опытной группы составило 1,0 — 11,2%, а в контрольной группе — 1,4—11,5%, что соответствует уровню, характерному для спонтанного повреждения головок сперматозоидов — 9,4 — 35,0% (рисунок 3). Результаты этих опытов позволяют считать, что «Байкал ЭМ1» не обладает мутагенной активностью.

Рис. 3. Характеристика спермиев в контрольной (1) и опытной (2) группах мышей

Влияние препарата «Байкал ЭМ1» на размножение дрожжевых клеток

В экспериментах использовали 0,01% раствор пекарских дрожжей в 0,1% растворе сахарозы. Контрольные и опытные образцы дрожжевого раствора помещали в термостат при 37°С, и клетки дрожжей подсчитывали в камере Горяева под микроскопом (объектив — х40, окуляр — х7) через 3 и 24 часа инкубации по формуле:

где X — число клеток в 1 мл среды; а — среднее число в 1 квадратике камеры Горяева;
25 — число подсчитанных квадратиков;
10⁷ — пересчетный коэффициент.

Опытные образцы отличались от контроля тем, что в них вводили рабочие растворы препарата «Байкал ЭМ1» в концентрации 1:10, 1:100 и 1:1000 (таблица 4).

Влияние препарата «Байкал ЭМ1» на изменение числа дрожжевых клеток (Nx10⁷)

 

Таблица 4   Группы экспериментов Время инкубации 3 часа 24 часа Контроль 1,69±0,02 2,30±0,12 Опыт 1 (1:10) 3,01±0,15 3,35±0,14 Опыт 2 (1:100) 2,70±0,15 2,90±0,12 Опыт 3 (1:1000) 1,86±0,07 2,14±0,04

Из таблицы 4 следует, что в сахарозной среде дрожжи усиленно размножались, и через 24 часа их число было статистически достоверно выше, чем к 3-му часу инкубации (Р<0,01). Под влиянием растворов препарата «Байкал ЭМ1» число дрожжевых клеток всегда оказывалось более значительным (3 часа), особенно при разбавлении 1:10 и 1:100, Р<0,001 и Р<0,01 соответственно. Эта закономерность сохранялась и к 24 часу опыта. При этом, за исключением опыта 3, во всех остальных опытах число дрожжевых клеток было выше, чем в контроле.

Полученные результаты свидетельствуют об эффективном влиянии пробиотика «Байкал ЭМ1» на усиление размножения и увеличение числа дрожжевых клеток. Эти данные могут иметь практически значимое производственное значение.

Действие препарата «Байкал ЭМ1» на клетки периферической крови

Цитологические эффекты препарата «Байкал ЭМ1» впервые были изучены на мышах, кроликах породы Советская шиншилла, курах кросса П-46, коровах черно-пестрой и симментальской пород. Полученные результаты весьма однотипны, поэтому приведем лишь результаты гематологических изменений у коров черно-пестрой породы (рисунки 4 и 5).

Из этих рисунков следует, что скармливание коровам препарата «Байкал ЭМ1» приводит к повышению в крови коров опытной группы уровня гемоглобина на 12,7 % и статистически достоверному повышению числа эритроцитов. Это отражает большую потенциальную способность препарата усиливать в организме коров окислительно-восстановительные процессы, стимулировать эритропоэз, улучшать снабжение кислородом. Более того, в крови коров опытной группы уменьшается скорость оседания эритроцитов на 9,9 %, что отражает ослабление скрытых воспалительных процессов в организме животных. Изменение лейкоформулы свидетельствует об усилении иммунологической резистентности подопытных коров.

Учитывая общебиологическую значимость повышения уровня гемоглобина, нами были проведены специальные эксперименты. Белым мышам-самцам per os в течение 4 недель вводили ежедневно по 1 мл препарата «Байкал ЭМ1», а контрольной группе мышей — дистиллированную воду. Затем мышей декапи- тировали, кровь лизировали и в лизате определяли содержание гемоглобина. У контрольных мышей концентрация этого белка равнялась 106,0±8,9 г/л, а у опытных—121,0±8,2 г/л (Р<0,02). Следовательно, другим методом еще раз было подтверждено, что препарат «Байкал ЭМ1» статистически значимо увеличивает содержание гемоглобина в периферической крови мышей.

Роль препарата «Байкал ЭМ1» в выделении казеина из молока и изменении его некоторых свойств

In vitro к цельному молоку (10 мл) прибавляли 10% от объема препарат «Байкал ЭМ1». Пробы инкубировали в термостате в течение одного часа при 37°С.

Установлено, что препарат за указанное время усиливает коагуляционные свойства молока. Так, в контрольных пробах молока масса казеина была равна в среднем 1,40±0,01 г, а после инкубации с пробиотиком она составляла 1,51±0,01 (Р<0,01). Препарат «Байкал ЭМ1» на 6,3% снижал в молоке буфернуюемкость, на 14,9% — влажность казеина, на 17,4% — количество золы, на 35,8% — уровень фосфора.

Под действием препарата «Байкал ЭМ1» не изменялось процентное содержание сухого остатка и кальция.

Следовательно, препарат «Байкал ЭМ1» повышает агрега- ционные свойства казеина, видимо, вследствие изменения заряда мицелл и способствует существенным изменениям физико-химических свойств этого белка.

Рис. 4. Влияние препарата «Байкал ЭМ1» на показатели крови коров

Примечание: 1 — контроль, 2, 3 и 4 — соответственно 10-й , 20-й и 30-й дни опыта

Рис. 5. Лейкоцитарная формула коров (в %) после 30-дневного скармливания препарата «Байкал ЭМ1»

Примечание: 1 — базофилы, 2 — эозинофилы, 3 — палочкоядерные нейтрофилы, 4 — сегментоядерные нейтрофилы, 5 — лимфоциты, 6 — моноциты

Влияние препарата «Байкал ЭМ1» на содержание ДНК в дрожжах

Для изучения влияния препарата «Байкал ЭМ1» на содержание ДНК в клетках готовили 1% раствор пекарских дрожжей на 0,95% растворе NaCl . Дрожжи гидролизовали. В гидролизате дрожжей определяли начальную концентрацию ДНК с помощью дифениламинового реактива. Этот раствор разделяли на 2 части и выдерживали в течение 3-х или 24-х часов в термостате при 37°С. В опытные образцы приливали препарат «Байкал ЭМ1» (1:10). После завершения инкубации в гидролизатах дрожжей проводили повторное определение количества ДНК.

Впервые нами установлено, что уже через 3 часа в опытных образцах количество ДНК оказалось на 38% больше, чем в контроле (Р<0,05). Через 24 часа инкубации количество ДНК возросло еще значительнее. В опытных пробах содержание ДНК было на 68% больше, чем в контроле.

Указанные изменения с большой долей вероятности свидетельствуют о том, что препарат «Байкал ЭМ1» усиливает размножение клеток дрожжей, отражением чего является повышение количества дезоксирибонуклеиновой кислоты.

5. Молекулярные механизмы действия препарата «Байкал ЭМ1»

Фундаментальные аспекты действия препарата «Байкал ЭМ1»

После основополагающих работ Л. Пастера была выполнена серия микробиологических исследований, имевших принципиальное значение для почвоведения и земледелия.

Установлено, что почвенная микрофлора совершенно необходима для перевода органических соединений гумуса в вещества, которые могут усваиваться растениями. В самом деле, в относительно недоступном состоянии в почве находятся запасы фосфатов; в виде солей ортокремниевой кислоты и алюмосиликатов находится калий; азот входит в состав сложных органических веществ перегноя и так далее. Для того чтобы мобилизовать указанные соединения и сделать их усвояемыми для культивируемых растений, почвенным микроорганизмам необходимо включать все присущие им биокаталитические системы. Наконец, сами микроорганизмы и другая микрофлора, их огромная постоянно возобновляемая органическая масса вносят существенный вклад в образование перегнойных веществ, а следовательно, и плодородия почвы.

Бактерии, грибы, черви, растительноядные клещи, слизни, насекомые и их личинки неустанно перерабатывают различные растительные остатки: корни, стерню, листья, траву и так далее. Почвенные животные не только разлагают растительные остатки на простые вещества, но и обогащают почву ферментами, витаминами и другими продуктами своей жизнедеятельности. Живые организмы почвы образуют уникальные биологические связи. Одни из них питаются растительными остатками, другие живут за счет бактерий и грибов, третьи являются хищниками, четвертые — санаторы и т. д. Однако все они постоянно преобразуют почву, необходимы для образования почвы, поддержания ее структуры и плодородия (Блинов В. А., 2003).

В середине XIX века стали ясны некоторые механизмы действия микробов, в частности стала понятна их роль в насыщении почвы азотом. Одним из первых С.Н. Виноградский (1863) выделил анаэробную бактерию Clostridium pasteurianum , которая усваивала элементарный азот атмосферы вне симбиоза с растениями. Затем М. Бейеринк (1901) подобное же действие наблюдал у аэробной бактерии Azotobacter chroococcum . В настоящее время азотфиксация (диазотрофность) рассматривается как связывание азота атмосферы и перевод его в азотсодержащие соединения микроорганизмами или цианобактериями. Первым стабильным продуктом является аммиак, синтез которого катализирует мультифермент нитрогеназа. Она состоит из Мо^е-белка (собственно нитрогеназа) и Fe -белка (редуктаза нитрогеназы). Активностью обладает лишь комплекс обоих компонентов.

Для функционирования нитрогеназы необходим непрерывный приток как энергии (в форме АТФ), так и электронов. Это достигается благодаря дыханию и брожению, происходящих в микроорганизмах или в результате фотосинтеза. При этом АТФ связывается с Fe -белком, и образовавшийся комплекс переносит электроны к Mo - Fe -белку. Восстановленная собственно нитрогеназа связывает молекулярный азот и превращает его в аммиак:

N₂ + 3H₂ → 2NH₃

Донором водородных атомов для нитрогеназного комплекса является НАДФНН.

Значит, кругооборот азота в природе представляет собой результат 4 процессов: образование аммиака путем связывания молекулярного азота в корневых клубеньках бобовых; нитрификация аммиака, то есть превращение его в нитраты; ассимиляция нитратов высшими растениями, что приводит к образованию аммиака и, наконец, синтез аминокислот из аммиака в растениях и организмах животных.

Для выяснения роли эффективных микроорганизмов в фундаментальных процессах азотфиксации нами по 13 параметрам исследованы образцы каштановой и черноземной почвы. Установлено, например, что под влиянием ряда разбавлений препарата «Байкал ЭМ1» (1:100, 1:1000) в каштановой почве существенно повы ш ается содержание нитратного азота, особенно к 8 — 12 неделям опыта. В опытных образцах почвы возрастает содержание подвижного фосфора, а также магния, ионов хлора, сульфатов, сухого остатка, незначительно — обменного кальция. Остальные исследованные показатели изменяются менее определенно, кроме уровня аммиачного азота, который либо снижался, либо даже не определялся.

Полученные данные свидетельствуют о том, что эффективные микроорганизмы способны целенаправленно вмешиваться в кругооборот азота, а именно во второй этап азотфиксации — нитрификацию аммиака. Усиленная трансформация аммиака в нитриты и нитраты под влиянием препарата «Байкал ЭМ1» отражает возрастание плодородия почвы. Аналогичные данные получены нами и при исследовании черноземной почвы.

Другим фундаментальным процессом нашей биосферы является фотосинтез — преобразование энергии света в энергию химических связей органических соединений. Потенциальная способность растений использовать энергию подающего света составляет 1516%, тогда как реальная — всего 1%. Исходя из этого, повышение интенсивности фотосинтеза является весьма актуальной проблемой, ибо фотосинтезирующие организмы, используя энергию Солнца, создают органические вещества из СО 2 и Н 2 О. Животные, извлекая эту законсервированную энергию Солнца, поддерживают свою жизнедеятельность, рост, развитие и размножение.

Нами в лабораторных и научно-производственных опытах различной направленности установлена способность эффективных микроорганизмов существенно увеличивать площадь фотосинтетических реакций, а следовательно, и образование органического вещества. Так, в условиях лаборатории показано, что под влиянием различных концентраций препарата «Байкал ЭМ1» существенно увеличивается длина проростков и корешков у семян зерновых: пшеницы, ржи, ячменя и кукурузы; бобовых: гороха и фасоли; технических культур: подсолнечника, горчицы, некоторых сортов столовой свеклы. В производственном опыте проростки гречихи были более однородны, не имели разнокалиберных ростков, всходы оказались дружными. Наблюдения в течение вегетативного периода показали, что гречиха на опытном поле развивается более успешно: стебли были мощными и высокими, число ветвей колебалось от 10 до 15 (в контроле 8 — 12), листья широкие, соцветия насыщенные. Гречиха на опытном поле цвела значительно дольше, чем на контрольном. Далее установлено, что под действием препарата «Байкал ЭМ1» происходит более мощное развитие ряда других растений. Так, высота и число листьев у томатов к концу шестой недели эксперимента были в среднем на 20% больше, чем в контроле. Обработка препаратом «Байкал ЭМ1» увеличивала число цветков и завязей томатов. При этом наиболее отчетливо выраженные позитивные результаты получены при предпосевной обработке семян препаратом в разбавлении 1:1000. Здесь число завязей увеличилось на 43%.

Аналогичные данные получены нами при исследовании салата сорта «Лолла-Росса» (таблица 5).

Изменение урожайности салата под влиянием препарата «Байкал ЭМ1»

 

Таблица 5   № Показатели Контроль Разбавления препарата «Байкал ЭМ1» 1:500 1:1000 1:2000 1 Длина листьев, мм 34,5±4,5 39,8±4,1 44,1±5,2 46,3±4,3 2 Ширина листьев, мм 33,9±2,5 32,6±3,4 37,4±3,3 38,9±2,9 3 Число листьев, шт. 3,7±1,0 4,8±1,2 4,1±1,1 4,9±1,1 Примечание: данные на 23-й день опыта.

Резюмируя результаты этой группы опытов, следует подчеркнуть, что указанные исследования, начатые нами в России одними из первых, сейчас неоднократно подтверждены на различных сельскохозяйственных, сидеральных культурах и других растениях. Полученные данные вполне однозначны и свидетельствуют о способности препарата «Байкал ЭМ1» повышать фотосинтетическую способность растений.

Влияние эффективных микроорганизмов препарата «Байкал ЭМ1» на активность ферментов

Ферменты растений

Нами в условиях лабораторного и научно-производственного опыта изучено влияние разных концентраций препарата «Байкал ЭМ1» на качественные показатели семян гороха сорта «Амброзия» и фасоли обыкновенной. Что касается ферментов, то на седьмой день опыта в проростках гороха и фасоли нами была определена активность каталазы, аскорбиноксидазы и амилазы (таблица 6).

Из таблицы 6 следует, что активность каталазы в проростках фасоли под влиянием препарата снижалась, а в проростках гороха изменялась неравномерно. Для фасоли это касается и в отношении аскорбиноксидазы и амилазы. В то же время активность двух последних ферментов в проростках гороха была статистически достоверно более высокой, чем в контроле (0,05>Р< 0,001).

Итак, впервые показано, что препарат «Байкал ЭМ1» существенно влияет на активность некоторых ферментов в прорастающих частях гороха и фасоли.

 

Таблица 6 Изменение активности ферментов в проростках гороха и фасоли под влиянием препарата «Байкал ЭМ1»   Показатели Горох Фасоль контроль Разбавления препарата контроль Разбавления препарата 1:500 1:1000 1:2000 1:500 1:1000 1:2000 Каталаза 0,33±0,05 0,33±0,01 0,16±0,05 0,20±0,01 0,40±0,01 0,58±0,06 1,06±0,09 0,50±0,03 Аскорбин оксидаза 0,088±0,07 0,134±0,0 0,239±0,05 0,164±0,04 0,164±0,16 0,179±0,03 0,045±0,018 0,104±0,09 Амилаза 0,174±0,02 0,660±0,07 0,280±0,09 0,210±0,06 1,19±0,53 0,47±0,04 2,79±0,14 0,31±0,05 Примечание: • активность каталазы выражали в количестве мл 0,1н KMn 04, пошедшего на титрование 1 г растительного объекта; • активность аскорбиноксидазы — в мл окисленной аскорбиновой кислоты на 1 г растительного материала; • активность амилазы — в мг гидролизованного крахмала за 30 мин. на 1 г растений.

 

Далее было установлено, что препарат «Байкал ЭМ1» оказывает общее стимулирующее действие на ферментный спектр семян подсолнечника и горчицы (таблица 7).

Из таблицы 7 видно, что препарат почти не влиял на активность аскорбиноксидазы. В то же время активность каталазы в проростках подсолнечника и горчицы однонаправленно увеличивалась под влиянием препарата «Байкал ЭМ1» на 21,8% и 49,2% соответственно, отражая общее усиление в тканях окислительновосстановительных процессов.

Что касается амилазы, то активность ее в проростках возрастала при обработке препаратом «Байкал ЭМ1» семян подсолнечника, но не горчицы. Полученные данные свидетельствуют, видимо, о разнонаправленном изменении скорости расщепления крахмала в проростках этих культур под влиянием препарата «Байкал ЭМ1».

Влияние препарата «Байкал ЭМ1» (1:500) на активность некоторых ферментов

 

Таблица 7       Проростки подсолнечника, 5 день Проростки горчицы, 6 день № Г руппы ферменты ферменты     каталаза аскорбинок- сидаза амилаза каталаза аскор бинок- сидаза амилаза 1 КОНТРОЛЬ 7,8±0,1 5,2±0,2 0,1±0,01 6,9±0,1 8,3±0,2 0,9±0,01 2 Опыт 9,5±0,3 5,2±1,4 0,2±0,01 10,3±1,7 7,1±0,3 0,3±0,05 Примечание: активность ферментов оценивалась, как в таблице 8.

Затем активность ферментов была определена в проростках ряда овощных культур (таблицы 8 — 10).

Изменение активности ферментов в проростках редиса

 

Таблица 8   Показатели Контроль РАЗВЕДЕНИЯ ПРЕПАРАТА 1:500 1:1000 1:2000 Каталаза 22,9±0,8 33,4±2,3 30,0±0,7 25,9±4,4 Аскорбиноксидаза 1,02±0,4 0,87±0,07 0,61 ±0,06 0,20±0,04

Примечание: активность ферментов определялась, как указано в таблице 8.

Изменение активности ферментов в проростках томата

 

Таблица 9   Показатели Контроль РАЗВЕДЕНИЯ ПРЕПАРАТА 1:500 1:1000 1:2000 Каталаза 0,08±0,01 0,53±0,03 0,33±0,02 0,80±0,02 Аскорбиноксидаза 0,02±0,0 0,20±0,03 0,26±0,01 0,37±0,06

Примечание: активность ферментов определялась, как указано в таблице 8.

Изменение активности ферментов в проростках салата

 

Таблица 10   Показатели Контроль РАЗВЕДЕНИЯ ПРЕПАРАТА 1:500 1:1000 1:2000 Каталаза 0,93±0,03 1,06±0,04 0,74±0,03 0,26±0,08 Аскорбин- 0,79±0,1 0,46±0,02 0,51 ±0,03 0,55±0,02 оксидаза Примечание: активность ферментов определялась, как указано в таблице 8.

Из таблиц 8 — 10 следует, что указанные овощные культуры существенно отличались между собой по активности каталазы, а также аскорбиноксидазы. Так, активность каталазы под влиянием разных концентраций препарата «Байкал ЭМ1» возрастала в томатах в 4,1 — 10 раз, в редисе — в 1,1 — 1,5 раза и снижалась в салате, за исключением опытов с разбавлением 1:500. Препарата «Байкал ЭМ1» весьма значительно повышал в томатах активность аскорбиноксидазы, в 10—18,5 раза. В то же время в остальных исследованных культурах она либо снижалась, либо существенно не отличалась от контрольных значений. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ростстимулирующее действие препарата «Байкал ЭМ1» опосредовано через активность ферментов. При этом окислительно-восстановительные процессы под влиянием препарата «Байкал ЭМ1» наиболее значительно усиливаются в томатах, тогда как для редиса и салата это оказалось нехарактерным.

Одним из более интересных ферментов растительных тканей является тирозиназа. Этот фермент является металлопротеином, содержащим медь. Тирозиназа относится к оксидазам и способна окислять субстраты (тирозин) кислородом воздуха. В наших экспериментах клубни сырого картофеля очищались от кожуры, нарезались кусочками и растирались в ступке до гомогенного состояния с дистиллированной водой и фильтровались. В опытные образцы фильтрата добавляли препарат «Байкал ЭМ1» в различных разбавлениях, а в контрольные — такой же объем дистиллированной воды. Пробы помещали в термостат при 37°С, и пробирки постоянно встряхивали для лучшего соприкосновения с кислородом воздуха. По окончании опыта сравнивали интенсивность окраски контрольных и опытных проб на КФК-2. Установлено, что препарат «Байкал ЭМ1» не изменил активность тирозиназы картофеля, о чем свидетельствовала практически одинаковая окраска жидкости во всех пробирках.

Ферменты животных

Сначала нами было показано, что препарат «Байкал ЭМ1» («Урга») повышает в крови цыплят кросса П-46 активность аспартат — и аланинаминотрансфераз, отражая их возрастающую роль в процессах трансаминирования аминокислот и свидетельствуя об улучшении функционального состояния печени. Изменение активности каталазы свидетельствовало об усилении окислительно-восстановительных процессов в организме цыплят, получавших с кормом препарат.

После скармливания коровам черно-пестрой породы препарата «Байкал ЭМ1» в крови у них также повышалась активность АлАТ и АсАТ. Что касается активности аспартатаминотрансфе- разы и аланинаминотрансферазы в молоке подопытных коров, то она всегда была выше, чем в контроле (Р<0,001). При этом расчетный коэффициент де Ритиса показывает, что отношение этих ферментов находится в норме. После прекращения скармливания препарата активность ферментов АсАТ, АлАТ в молоке и содержание в нем некоторых метаболитов (общего белка, мочевины и глюкозы) приблизились к контрольным значениям (таблица 11).

Эти и другие полученные нами впервые данные позволяют считать, что у коров черно-пестрой коровы под влиянием препарата «Байкал ЭМ1» улучшается биосинтез белка и трансформация аминокислот, возрастает содержание предшественников энергетического обмена, улучшается функциональное состояние печени.

Изменение некоторых метаболитов крови и молока коров под влиянием препарата «Байкал ЭМ1»

 

Таблица 11   Группы животных Дни опыта КРОВЬ МОЛОКО АсАТ, мккат/л АлАТ, мккат/л Коэффи циент де Ритиса АсАТ, мккат/л АлАТ, мккат/л Коэффи циент де Ритиса Контрольная 0 0,720±0,02 0,608±0,04 1,18 0,188±0,03 0,126±0,02 1,49 Опытная 10 0,864±0,03 0,740±0,02 1,17 0,116±0,01 0,099±0,02 1,17 20 0,932±0,02 0,806±0,04 1,16 0,088±0,01 0,065±0,007 1,35 30 0,948±0,04 0,826±0,04 1,15 0,121±0,01 0,098±0,006 1,23

 

Роль препарата «Байкал ЭМ1» в изменении активности и специфичности ферментов

В этих опытах использовали два фермента: амилазу и саха- разу пекарских дрожжей. Сначала было оценено влияние амилазы на скорость расщепления крахмала. В этих экспериментах использовали разбавления препарата «Байкал ЭМ1» 1:10, 1:100 и 1:1000. Установлено, что во всех пробах расщепление крахмала начинается через 15 мин. от начала инкубации в термостате при 37°С. Однако уже через 20 мин. различия стали вполне определенными: в пробах с препаратом «Байкал ЭМ1» (1:10) расщепление крахмала оказалось более значительным, вследствие чего окраска жидкости в этих пробирках практически исчезла.

Итак, препарат «Байкал ЭМ1» в высокой концентрации способствовал повышению активности амилазы слюны в расщеплении субстрата.

Как установлено далее, препарат оказался индифферентным по отношению как к активаторам, так и ингибиторам активности амилазы. Иными словами, он не стимулировал действие активатора (NaCl) и не препятствовал торможению активности фермента ингибитором (CuSO4). Следовательно, препарат «Байкал ЭМ1» сам способен привносить дополнительную активность амилазы, подтверждая ранее описанный аналогичный эффект препарата на мицелий шампиньонов.

Затем в двух вариантах экспериментов было показано, что препарат «Байкал ЭМ1» (1:10) обладает незначительной сахарозной активностью. В первом варианте препарат незначительно расщеплял сахарозу на глюкозу и фруктозу, что подтверждается пробой Троммера. Во втором варианте был использован высокоточный ферментативный метод определения глюкозы и исследовалась активность сахарозы дрожжей.

Установлено, что под влиянием препарата «Байкал ЭМ1» активность сахарозы пекарских дрожжей возрастала на 3 — 5% .

Мембранно-протекторное действие препарата «Байкал ЭМ1»

Мембраны животных клеток выполняют две важнейшие функции: обеспечивают транспорт питательных веществ внутрь клетки, а экзоцитоз отработанных соединений — в интерстициальную жидкость и поддержание на постоянном уровне внутриклеточного осмотического давления. Нарушение указанных функций мембран лежит в основе многих патологических симптомов, синдромов и заболеваний.

Нами впервые изучено изменение осмотической резистентности эритроцитов крови у животных разных видов под влиянием препарата «Байкал ЭМ1».

Сначала представим результаты, полученные in vitro.

Для изучения влияния препарата «Байкал ЭМ1» на осмотическую резистентность эритроцитов использовали кровь крупного рогатого скота. В пробирки помещали по 0,2 мл крови коров. Часть пробирок служила контролем, а в опытные пробирки приливали препарат «Байкал ЭМ1» из расчета 1:10, 1:100 и 1:1000. Кровь инкубировали в течение 3 часов при комнатной температуре. Затем определяли осмотическую резистентность эритроцитов.

Установлено, что при всех разбавлениях препарата наблюдалось смещение амплитуды резистентности эритроцитов в пользу увеличения их устойчивых форм. Наиболее отчетливые результаты оказались при введении 1 части препарата на 100 частей крови. При этом число осмотически устойчивых эритроцитов увеличилось на 11,9%. Данные, полученные in vitro , свидетельствуют о способности препарата «Байкал ЭМ1» увеличивать стойкость биомембран эритроцитов. После получения таких результатов в более широком плане мембранно-протекторное действие препарата «Байкал ЭМ1» изучено нами в опытах in vivo (рисунок 6).

Для определения устойчивости мембран эритроцитов лабораторным белым мышам ежедневно в течение 10 дней перорально вводили препарат «Байкал ЭМ1» в дозе 1 мл. Другая группа животных была контрольной. На 11 день у мышей брали кровь для анализа из хвостовой вены.

Резистентность эритроцитов исследовали по отношению к гипотоническим растворам хлористого натрия. Для этого готовили ряд разбавлений физиологического раствора NaCl (от 0,70% до 0,20%, с «шагом» 0,02%). В центрифужные пробирки наливали по 4 мл гипотонических растворов NaCl различной концентрации (всего 26 пробирок). Затем в каждую пробирку с помощью капилляра от гемометра Сали вносили по 0,02 мл крови. Затем центрифугировали в течение 5 минут при 3000 об./мин. Для определения степени гемолиза эритроцитов надосадочную жидкость фотоко- лориметрировали при А=490 нм.

Установлено, что минимальная резистентность эритроцитов, или верхняя граница осмотической резистентности, у подопытных мышей была равна 0,47±0,0061% NaCl , тогда как в норме — 0,43±0,0061% NaCl (Р<0,01). Следовательно, in vivo устойчивость мембран эритроцитов мышей, получавших препарат «Байкал ЭМ1», к литическому действию концентраций поваренной соли оказывалась выше на 9,3%, чем в контроле. Иными словами, препарат «Байкал ЭМ1», введенный в организм мышей, оказывал мембранно-протекторное действие. Аналогичные данные получены и в отношении максимальной резистентности эритроцитов, или нижней границы осмотической резистентности. Так, в контрольной группе мышей она была равна 0,35±0,0061% NaCl , а в опытной — 0,29±0,0061% NaCl (Р<0,01).

Наконец, общая граница резистентности мембран эритроцитов крови мышей при введении препарата «Байкал ЭМ1» расширилась в среднем на 30,0%. Такие изменения вновь свидетельствуют о возросшей прочности биомембран эритроцитов под действием препарата «Байкал ЭМ1».

Затем эксперименты такой же направленности были проведены на кроликах. С этой целью сформированы контрольная и подопытная группы кроликов породы Советская шиншилла по 10 голов в каждой, средней массой 690,50±4,55 г и 698,10±4,55 г соответственно. Возраст животных — 50 дней.

Кролики обеих групп в течение трех месяцев содержались в одинаковых условиях и получали сбалансированный по питательности рацион. Кроме того, кролики подопытной группы ежедневно во время утреннего кормления в течение 90 дней получали препарат «Байкал ЭМ1» по 0,2 мл на 1 кг живой массы в смеси с молотым зерном. Через 3 месяца у кроликов обеих групп брали кровь для анализа из ушной вены.

Нами установлено, что у кроликов, получавших препарат «Байкал ЭМ1», также как и у мышей, расширилась амплитуда резистентности за счет увеличения верхней границы концентрации NaCl с 0,43±0,017% в контроле до 0,46±0,0057% NaCl в опыте. Нижняя граница резистентности у этих животных практически не изменялась и была на уровне 0,30±0,011% NaCl.

Рис. 6. Изменение осмотической резистентности эритроцитов мышей (1), кроликов (2) и коров (3, 4, 5) соответственно 10, 20, 30-й дни опыта. Темные символы — контроль, светлые символы — опыт.

Итак, препарат «Байкал ЭМ1» у подопытных кроликов, так же, как и у мышей, способствовал увеличению числа молодых эритроцитов (в среднем на 7%), что, с одной стороны, отражает улучшение функциональной деятельности органов кроветворения, а с другой — свидетельствует о мембранно-протекторном действии препарата «Байкал ЭМ1», хотя граница резистентности эритроцитов у кроликов подопытной группы увеличилась всего на 7,0%.

Для изучения влияния препарата «Байкал ЭМ1» на крупных сельскохозяйственных животных мы провели дополнительные опыты на коровах.

Были сформированы контрольная и подопытная группы из коров черно-пестрой породы 2-3 лактации по 10 голов в каждой. Коровы на ферме (ЗАО ПЗ «Трудовое») содержались в условиях, близких к стандартным, получали основной рацион, сбалансированный по питательной ценности. В течение 30 дней ежедневно во время вечернего кормления подопытные коровы в дополнение к основному рациону получали препарат «Байкал ЭМ1» по 30 мл на голову в смеси с зерновым концентратом.

Для исследования динамики гематологических показателей каждые 10 дней до начала утреннего доения и раздачи корма у коров брали кровь из яремной вены.

Важно отметить, что на 10 день эксперимента увеличилась амплитуда резистентности эритроцитов за счет смещения верхней границы от 0,50±0,0065% NaCl в контроле до 0,53±0,0071% NaCl — в опыте. Разрушение наиболее устойчивых форм эритроцитов происходило в 0,44±0,0071%-ном растворе NaCl , тогда как в контроле — при 0,53±0,0071% NaCl . При этом число наименее устойчивых эритроцитов уменьшилось на 6,0%, а граница резистентности увеличилась на 8,3%.

Статистически достоверное увеличение амплитуды резистентности эритроцитов отмечено на 20-й день опыта за счет смещения верхней границы до 0,60±0,013% NaCl , а нижней — до 0,42±0,0043% NaCl . При этом граница осмотической резистентности возросла на 27,1% по сравнению с контролем.

Отчетливые результаты получены нами также и на 30 день опыта, когда минимальная осмотическая резистентность эритроцитов у подопытных коров увеличилась с 0,50±0,0065% NaCl до 0,62±0,0 l 9% NaCl , отражая появление большего числа молодых форм эритроцитов. Наиболее устойчивые формы эритроцитов разрушались, как и на 20 день опыта, в 0,42±0,0053%-ном растворе NaCl . Это оказывалось на 6,7% ниже, чем в контрольной группе коров, а граница резистентности эритроцитов была равна 30,7%.

Таким образом, впервые полученные нами данные позволяют считать, что применение препарата «Байкал ЭМ1» в качестве кормовой добавки для разных видов животных препятствует разрушению мембран эритроцитов в осмотически неадекватной среде, то есть препарат «Байкал ЭМ1» обладает мембранно-протекторным действием, а также улучшает функцию органов кроветворения.

Мобилизация фосфата ДНК под действием препарата «Байкал ЭМ1»

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) состоит из трех компонентов: пуринового и пиримидинового азотистого основания, дезоксирибозы и фосфорной кислоты. Предварительно мы установили, что препарат «Байкал ЭМ1» усиливает размножение пекарских дрожжей, увеличивая в них содержание ДНК. Можно было предположить, что препарат «Байкал ЭМ1» одновременно с увеличением числа дрожжевых клеток будет способствовать и увеличению компонентов ДНК при ее гидролизе. В ниже приведенных опытах о содержании этой биомолекулы мы судим по изменению количества фосфата.

В экспериментах использовали 1% раствор пекарских дрожжей, приготовленный на физиологическом растворе, который делили на две части. В контрольные пробы приливали 10% физраствора, а в опытные—10% препарата «Байкал ЭМ1» (1:10). Все пробы помещали в термостат на 3 и 24 часа при температуре 37°С. Затем контрольные и опытные образцы дрожжей гидролизовали 10% раствором серной кислоты при кипячении. Полученный гидролизат нейтрализовали 10% NaOH , и в нем определяли содержание фосфата фотоколориметрическим методом (А=670 нм).

Установлено, что до инкубации содержание фосфата в растворе дрожжей составляло 1,65±0,10 г/дл. Через 3 часа после инкубации в термостате в контрольных образцах уровень фосфата несколько возрос, до 1,95±0,13 г/дл (Р>0,5), а в опытных пробах он увеличивался более значительно, до 2,13±0,14 г/дл ( P <0,05). Еще более четко были выражены эти различия через 24 часа от начала инкубации. Так, в контрольных пробах содержание фосфата, по сравнению с исходным уровнем, возросло на 46,1% и составило 2,41±0,03 г/дл (Р<0,05), а в опытных — на 69,7% (2,80±0,07 г/дл; Р<0,01).

Мы считаем, что препарат «Байкал ЭМ1» не только увеличивает количество дрожжевых клеток, но и, действуя на молекулярном уровне, способствует большей мобилизации фосфата из ДНК. Иными словами, препарат «Байкал ЭМ1», видимо, обладает определенной ДНКазной активностью.

Влияние препарата «Байкал ЭМ1» на молекулярные механизмы транспорта углеводов в ткани

Из более чем пятидесяти гормонов млекопитающих и человека лишь инсулин обладает явно выраженным анаболическим действием. Для этого гормона характерно множество механизмов действия. Основным является усиленный транспорт глюкозы через плазматическую мембрану клеток. Молекулярные механизмы такого эффекта инсулина заключаются в том, что он, распластываясь на биомембране, повышает ее проницаемость к глюкозе, способствуя усиленному транспорту. Иными словами, инсулин действует по мембранному механизму, и сам не проникает внутрь клетки. При недостатке инсулина развивается сахарный диабет, для которого характерно повышение порога чувствительности периферических тканей к глюкозе, то есть глюкозы в организме больных достаточно, но она не может утилизироваться в клетках.

Инсулин существует в организме в двух формах. Одна из них — это свободный инсулин, а другая — связанный. При последней форме инсулин ассоциирован с жировой тканью, и для эффекта его действия необходимо удалить жировой компонент. Впервые в наших опытах оценивалась эффективность обеих форм инсулина в организме крыс под влиянием препарата эффективных микроорганизмов. С этой целью провели эксперименты следующей направленности.

Диафрагму брали от крыс, предварительно голодавших 16 — 18 часов. Животных декапитировали, быстро вырезали диафрагму, ополаскивали в охлажденном 0,9% растворе хлорида натрия. Далее диафрагму разрезали на две равные части, слегка обсушивали фильтровальной бумагой и помещали в специальные бюксы, одна часть диафрагмы служила контролем, а другая — опытом.

В контрольные бюксы с диафрагмой наливали 0,9% раствор хлорида натрия, а в опытные — 0,9% NaCl с добавлением препарата «Байкал ЭМ1» в соотношении 1:10. Бюксы помещали в термостат с температурой 37°С.

Через сутки контрольные и опытные полудиафрагмы тщательно отмывали 0,9% раствором NaCl и помещали в раствор, содержащий 10 ммоль/л глюкозы. Через 1, 2 и 24 часа глюкозо- оксидазным методом определяли уровень глюкозы в растворе. Все результаты выражали в ммоль глюкозы, поглощенной за определенный промежуток времени, на один грамм веса диафрагмы.

В течение первого часа наблюдения поглощение глюкозы контрольной диафрагмой составило 0,24±0,02 ммоль/г, а опытной— 0,27±0,03 ммоль/г. Далее потребление глюкозы нарастало и к концу второго часа наблюдения составило соответственно 0,63±0,13 и 0,70±0,06 ммоль/г. Через 24 часа суммарное потребление глюкозы контрольной диафрагмой составляло 1,02±0,18, а опытной—1,19±0,17 ммоль/г.

На всем протяжении эксперимента в опытной диафрагме потребление глюкозы было выше, чем в контрольной на 11,1 — 16,7%.

Опыты аналогичной направленности проводили на полудиафрагмах крыс, но без предварительной 24-х часовой инкубации в препарате «Байкал ЭМ1». В этой серии контрольные полудиафрагмы помещали в раствор глюкозы (10 ммоль/л), а опытные — в аналогичный раствор с добавлением препарата в разбавлении 1:10. Через 1, 2 и 24 часа проводили определение уровня глюкозы в инкубационной среде. В этом варианте эксперимента были получены идентичные результаты. Так, через 1 час от начала инкубации потребление глюкозы контрольной диафрагмой составляло 0,16±0,02 ммоль/г, а опытной — 0,23±0,07 ммоль/г (Р>0,05). Через два часа эти показатели составили соответственно 0,41±0,09 и 0,70±0,09 ммоль/г, а через 24 часа — 0,97±0,09 и 1,44±0,15 ммоль/г (Р<0,05).

Следовательно, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что препарат «Байкал ЭМ1» обладает инсулиноподобной активностью, характерной для свободного инсулина.

Затем исследования по изучению связанного инсулина проводили на эпидидимальном жире — жировой ткани придатка семенника. Через 24 часа от начала инкубации поглощение глюкозы контрольной жировой тканью составляло 0,23±0,02 ммоль/г, а опытной — на 13,0% больше — 0,26±0,02 ммоль/г (Р>0,05).

Таким образом, нами впервые установлено, что под действием препарата «Байкал ЭМ1» наблюдается тенденция к более интенсивному включению глюкозы в мышечную и жировую ткани лабораторных крыс. Иными словами, препарат «Байкал ЭМ1» обладает инсулиноподобной активностью и способен на молекулярном уровне регулировать транспорт глюкозы в клетки.

Некоторые эффекты препарата «Байкал ЭМ1»

Изменение содержания АТФ и КФ

В печени, мышцах и других тканях животных содержатся два основных макроэргических соединения: аденозинтрифосфор-

ная кислота (АТФ) и креатинфосфат (КФ), которые являются в организме депо энергии. Эксперименты проведены на цыплятах и кроликах. Данные, полученные на птице, суммированы в таблице 12.

 

Таблица 12 Влияние препарата «Байкал ЭМ1» на суммарное содержание АТФ и КФ (мг/г) в тканях         ТКАНИ № Г руппы n печень мышцы       1 2 1 2 1 Контроль 5 57,86±5,75 32,74±11,07 18,72±1,04 18,66±7,76 2 Опыт 5 89,68±3,99 36,61±16,11 24,38±1,97 21,20±10,49 Примечание: n — число цыплят в группе; 1 и 2 — месяцы наблюдения.

Из таблицы 12 следует, что суммарное содержание этих молекул-макроэргов резко повы ш ается как в ткани печени, на 55% (Р<0,01), так и в мышечной ткани, на 30,2% (Р<0,05). Препарат «Байкал ЭМ1» вводили цыплятам (1:1000) с питьевой водой или кормом в течение одного месяца. К концу второго месяца исследования (препарат не давали в течение 30 дней) содержание АТФ + КФ в обеих группах стало одинаковым. Итак, впервые установлено, что препарат «Байкал ЭМ1» («Урга») весьма существенно увеличивал в организме цыплят биосинтез основных макроэргических соединений.

Интегративным показателем, характеризующим эффективность биодобавок к корму, является изменение живой массы тела животных. Данные наших опытов этой направленности представлены в таблице 13.

Как следует из таблицы 13, подопытные кролики наращивали живую массу значительно быстрее, чем контрольные. Так, через 1, 2 и 3 месяца прирост живой массы, по сравнению с исходной, составил у них соответственно 44,7; 80,6 и 110,0%, тогда как в контроле прирост был равен всего 28,3; 52,2 и 77,3%. Следовательно, препарат весьма существенно стимулировал увеличение живой массы у кроликов. К концу исследования она была больше, чем в контрольной группе, в среднем на 20,4%.

Изменение живой массы кроликов под влиянием препарата «Байкал ЭМ1»

 

Таблица 13   № Группа Масса, г в начале опыта через 1 месяц через 2 месяца через 3 месяца 1 Конт роль 690,50±4,55 886,10±10,17 1050,60±10,93 1223,40±8,87 2 Опыт 698,10±4,55 1010,70±10,28 1260,70±9,96 1473,30±8,33   р   < 0,001 < 0,001 < 0,001

Препарат «Байкал ЭМ1», введенный в рацион кроликов, не изменял органолептических свойств мяса, однако содержание АТФ и креатинфосфата в мышечной ткани и печени животных контрольной и опытной групп было практически одинаковым, что диктует необходимость проведения дополнительных исследований.

Протеолитическое действие препарата «Байкал ЭМ1»

При проведении этих экспериментов был использован 10% водный раствор яичного белка, который на 70% состоял из альбуминов. Для удаления меньшей части белка — глобулиновой — полученный раствор яичного белка разбавляли дистиллированной водой (1:10), и выпавший в осадок глобулин отделяли от остального раствора центрифугированием. Полученный таким образом раствор яичного альбумина разделяли на 4 порции—контрольную и 3 опытные. В опытные образцы вводили препарат «Байкал ЭМ1» (10% от объема) в разбавлении 1:10, 1:100, 1:1000. В контрольные образцы в таком же объеме вводили физиологический раствор. Контрольные и опытные пробы анализировали до, через 3 и 24 часа после их инкубации в термостате при 37°С. Затем формоловым титрованием определяли протеолитическую активность препарата «Байкал ЭМ1».

Установлено, что через сутки от начала опыта в контрольных пробах существенно снизился процесс гидролиза альбумина и образования свободных карбоксильных групп. В опытных образцах распад белка всегда оказывался более значительным. Иными словами, впервые установлено, что препарат «Байкал ЭМ1» за счет ферментативной активности усиливает катаболизм белков, способствуя появлению смеси аминокислот. Видимо, поэтому корм, ферментированный препаратом «Байкал ЭМ1», приобретает большую питательную ценность и лучше усваивается сельскохозяйственными животными и птицей.

Влияние препарата «Байкал ЭМ1» на спиртовое брожение

Известны различные виды брожения, обычно они называются по конечным продуктам, образующимся в процессе трансформации органических веществ.

В бродильных производствах используют различные микроорганизмы: дрожжи, бактерии, микромицеты. Для производства этанола используют, например, дрожжи Saccharomyces, а также Clostridium Saccharobutyricum.

Нами для изучения влияния микроорганизмов препарата «Байкал ЭМ1» на сбраживание углеводов приготавливалась инкубационная смесь следующего состава: дрожжи — сахароза — вода в соотношении 1:50:200. В опытные смеси через сутки от начала брожения добавляли препарат «Байкал ЭМ1» в разбавлении 1:10 (первая опытная группа), 1:100 (вторая опытная группа), 1:1000 (третья опытная группа).

Инкубацию сред проводили в термостате при температуре 37°С. Через 5 дней от начала опыта дрожжи отделяли центрифугированием и в супернатанте титрометрическим методом определяли содержание спирта.

Установлено, что в контрольной смеси содержание спирта через пять дней брожения составляло 5,92±0,25%. Под действием препарата «Байкал ЭМ1» в разбавлении 1:10 этот показатель увеличился на 4,6% и составил 6,19±0,48% (Р>0,05). При добавлении препарата в разбавлении 1:100 и 1:1000 концентрация спирта в опытных пробах также оказывалась несколько повышенной и составляла соответственно 6,05±0,79 и 6,01±0,57%.

Таким образом, под действием микроорганизмов препарата «Байкал ЭМ1» наблюдается тенденция к интенсификации процессов брожения углеводов и к увеличению продукции спирта. Можно предположить, что важную роль в этом играют дрожжи, входящие в состав препарата, а также стимуляция ферментативных реакций на молекулярном уровне в пекарских дрожжах, вводившихся в инкубационную среду.

6. Заключение

В настоящее время все интенсивнее изучается роль непатогенных микроорганизмов в сохранении плодородия почвы, повышении урожайности различных сельскохозяйственных культур, профилактике многих заболеваний животных и увеличении их продуктивности, получении экологически безопасной продукции и, в конечном счете, в нормализации и улучшении жизнеобеспечения людей.

Перспективным в этом отношении является использование эффективных микроорганизмов, составляющих основу ЭМ-технологии, внедренной во многих странах мира как технологии биологического земледелия и восстановления эволюционно сложившихся экосистем. Детальное выяснение всего спектра действия препаратов эффективных микроорганизмов только начинается, и как всякая инновация встречает определенное противодействие и скепсис, хотя многочисленные отечественные и зарубежные исследования практически однозначно свидетельствуют о позитивной роли ЭМ-технологии в различных областях сельского хозяйства.

Объяснению многих эффектов этой уникальной технологии в значительной степени способствовало бы выяснение их цитологических и молекулярных механизмов действия. Такие механизмы неизвестны. Впервые они стали изучаться сотрудниками кафедры биотехнологии, органической и биологической химии Саратовского ГАУ, благодаря финансовой поддержке научной части университета.

В результате проведенных исследований, установлены следующие, в том числе и фундаментальные, факты

• Впервые детально изучены физико-химические, морфологические и биохимические свойства двух препаратов эффективных микроорганизмов: «Байкал ЭМ1» и «Тамир». Разработаны новые подходы для определения активности препарата «Байкал ЭМ1» — по способности потреблять субстрат и по способности повышать заведомо низкие посевные качества семян.

• Впервые установлено, что препарат «Байкал ЭМ1» не обладает мутагенным, тератогенным, канцерогенным, аллергогенным, пирогенным действием. Изучено его влияние на важней ш ие биохимические показатели, морфологию внутренних органов, основные физикальные параметры животных, оценена острая и хроническая токсичность этого препарата.

• Показана положительная кинетика размножения клеток пекарских дрожжей под влиянием различных концентраций препарата «Байкал ЭМ1», что открывает дополнительные перспективы для интенсификации производства дрожжей.

• Цитологические проявления препарата «Байкал ЭМ1» на периферическую кровь различных животных (мыши, кролики, коровы) свидетельствуют об усилении процессов кровеобразования (повышение содержания гемоглобина и эритроцитов), лейкопоэза, усилении иммунологической резистентности и уменьшении в организме скрытых очагов воспаления. Полученные результаты открывают новые перспективы общебиологического и прикладного характера.

• Препарат «Байкал ЭМ1» усиливает коагуляцию белков молока, снижает его буферную емкость, уменьшает количество золы, фосфора, но не сухого остатка и кальция.

• Впервые на каштановых и черноземных почвах установлена способность препарата «Байкал ЭМ1» усиливать трансформацию азота аммиака в азот нитратов, то есть ускорять один из этапов азотфиксации — фундаментального молекулярного процесса повышения плодородия почвы.

• Подтверждена способность препарата «Байкал ЭМ1» усиливать реакции фотосинтеза, а, следовательно, и образование органического вещества, что может иметь принципиально важное практическое значение для более эффективного выращивания кормовых культур.

• Активность ферментов как молекулярных структур под влиянием препарата «Байкал ЭМ1» изменяется в зависимости от вида сельскохозяйственных культур, животных и птицы. Препарат «Байкал ЭМ1» повышает активность энзимов in vitro и не изменяет их конформации, о чем свидетельствует индифферентность ферментов к действию активаторов и ингибиторов. Перспективным и важным является установление того факта, что препарат «Байкал ЭМ1» обладает амилазной, протеолитической и ДНКазной активностью.

• Впервые на эритроцитах крови мышей, кроликов и коров черно-пестрой породы установлено мембранно-протекторное действие препарата «Байкал ЭМ1» к изменению осмотического давления в культуральной жидкости.

• У белых лабораторных мышей под влиянием препарата «Байкал ЭМ1» в печени и мышцах достоверно возрастает суммарное количество АТФ и КФ-основного динамического резерва энергии в организме. Подобный эффект не установлен для кроликов, что диктует необходимость проведения новых экспериментов в области биоэнергетических систем.

• Установлено, что препарат «Байкал ЭМ1» не только увеличивает количество ДНК в дрожжевых клетках, но и, действуя на молекулярном уровне, способствует большей мобилизации фосфата из ДНК.

• Молекулярные механизмы действия эффективных микроорганизмов на транспортные системы клеток проявляются более значительным переносом углеводов из инкубационной жидкости в клетки мышечной и жировой тканей.

• Установлена способность препарата «Байкал ЭМ1» увеличивать скорость брожения и образования спирта дрожжевыми клетками Saccharomyces cerevisiae.